發(fā)布時(shí)間：2021-09-05 13:47

　　乳腺炎是影響奶牛生產(chǎn)的主要疾病之一�？焖贉�(zhǔn)確鑒定出引起奶牛乳腺炎發(fā)病的主要病原體,對(duì)奶牛乳腺炎的防治、患病牛只的隔離治療、凈化牛群以及保證牛群健康生產(chǎn)具有十分重要的意義。但在生產(chǎn)實(shí)踐中,受到儀器設(shè)備、人員水平和養(yǎng)殖區(qū)域等現(xiàn)實(shí)條件制約,現(xiàn)有奶牛乳腺炎檢測技術(shù)顯的相對(duì)滯后。常規(guī)培養(yǎng)基檢測病原的方法繁瑣費(fèi)時(shí),而且經(jīng)常出現(xiàn)假陽性結(jié)果。而利用PCR方法檢測某一病原體的方法對(duì)操作人員水平和設(shè)備要求較高、不便在一線養(yǎng)殖中全面推廣。因此,開發(fā)快速、特異、靈敏、便捷、經(jīng)濟(jì)適用的奶牛乳腺炎病原菌檢測方法具有重要的應(yīng)用推廣價(jià)值和市場需求。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是一種新型等溫核酸擴(kuò)增技術(shù),因其檢測的特異性好、靈敏度高、耗時(shí)短、可操作性強(qiáng)等多種優(yōu)點(diǎn),近些年該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲等多種病原生物的檢測中,在人、畜等的病原物檢測及疾病的早期診斷等領(lǐng)域有著十分廣闊的應(yīng)用前景。本研究通過技術(shù)優(yōu)化和方案改進(jìn),建立了基于LAMP檢測奶牛乳腺炎主要致病菌的方法。主要內(nèi)容包括:（1）結(jié)合鹽酸胍裂解液和核酸提取柱,建立了從牛奶中快速... 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

奶牛乳腺炎發(fā)展示意圖

進(jìn)行鏈置換反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)恒定溫度條件下對(duì)目的 DNA 片段進(jìn)行體外快速擴(kuò)增。該技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)是引物設(shè)計(jì)，引物設(shè)計(jì)主要包括兩點(diǎn)：促使反應(yīng)起始物的形成；擴(kuò)增末端能夠形成獨(dú)特莖環(huán)結(jié)構(gòu)以使反應(yīng)能夠循環(huán)。LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)包括三個(gè)過程:引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)起始物形成以及擴(kuò)增的往復(fù)循環(huán)。LAMP 反應(yīng)檢測的優(yōu)點(diǎn)有：（1）特異性強(qiáng)、靈敏度高。比PCR 擴(kuò)增的靈敏度高出1~2 個(gè)數(shù)量級(jí)；（2）反應(yīng)快速高效、反應(yīng)條件簡單。不需要 PCR 的預(yù)變性步驟，核酸的擴(kuò)增在水浴鍋中或恒溫箱恒溫條件下反應(yīng)1h 左右就可以完成；（3）結(jié)果易于觀察。通過自然光下看渾濁度，直接觀察或高速離心后觀察是否有沉淀，也可加入不同的顯色劑來觀察顏色變化。3.2 LAMP 反應(yīng)原理鏈置換型 DNA 聚合酶（如圖 2）：這種聚合酶（Bst DNAPolymerase）最適溫度是 65℃，在擴(kuò)增雙鏈 DNA 時(shí)能對(duì)其中一條鏈邊解離邊伸長。

LAMP 的擴(kuò)增分大致分為三個(gè)階段：1）循環(huán)模板合成階段由于雙鏈 DNA 模板在 60 ℃ ~65℃環(huán)境下處于不穩(wěn)定、動(dòng)態(tài)的平衡狀態(tài)，此時(shí)在大片段鏈置換型 DNA 聚合酶( Bst DNApolymerase)的催化作用下，該反應(yīng)體系的正向內(nèi)引物 FIP 外引物 F3 依次與各自位點(diǎn)特異性結(jié)合（如圖 3），形成兩條各自互補(bǔ)的 DNA 單鏈，新合成的 DNA 單鏈其中一端存在能與自身互補(bǔ)配對(duì)的堿基片段，這部分自配對(duì)生成帶有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的 DNA 單鏈。隨后反向內(nèi)引物 BIP 和外引物 B3 依次結(jié)合到各自匹配的特異性結(jié)合位點(diǎn)，并打開DNA 單鏈在上一步形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)合成了兩端反向的環(huán)狀結(jié)構(gòu)鏈。因此，當(dāng)整條鏈呈現(xiàn)出啞鈴狀結(jié)構(gòu)時(shí)，LAMP 擴(kuò)增的起始階段完成了。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]奶牛肝功能酶檢測與乳房炎白色念珠菌快速診斷試紙條研究[D]. 劉平.廣西大學(xué) 2013

碩士論文
[1]南寧某牛場奶牛乳房炎調(diào)查及其快速檢測方法的建立與應(yīng)用[D]. 鄒佳琪.廣西大學(xué) 2016
[2]奶牛鏈球菌性乳房炎可視化LAMP檢測方法的建立及應(yīng)用[D]. 賀婷.廣西大學(xué) 2014



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