為建立一種可同時(shí)快速準(zhǔn)確檢測(cè)5種菌毛類(lèi)型的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）的多重PCR方法,本研究首先通過(guò)大腸桿菌特異性基因uidA的PCR方法鑒定大腸桿菌;選取國(guó)內(nèi)外流行的攜帶K88、K99、F18ab、F18ac和F41菌毛基因的ETEC菌株,根據(jù)這5種菌毛基因的保守序列設(shè)計(jì)5對(duì)特異性引物,通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立了能同時(shí)檢測(cè)上述5種菌毛ETEC的多重PCR方法。uidA基因的PCR結(jié)果顯示,除了大腸桿菌有特異性擴(kuò)增外,其他細(xì)菌均不能擴(kuò)增,可以用于大腸桿菌的鑒定。菌毛多重PCR優(yōu)化后的反應(yīng)條件為:各混合菌毛基因引物終濃度為3.2μmol/L,各大腸桿菌混合DNA模板濃度為2.5×107拷貝/μL,退火溫度為58℃;特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示,該多重PCR方法能夠特異性擴(kuò)增5種ETEC的菌毛基因,而豬源沙門(mén)氏菌、豬源鏈球菌和大腸桿菌DH5α未見(jiàn)擴(kuò)增,特異性強(qiáng);敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示,該方法對(duì)攜帶5種菌毛的大腸桿菌基因組DNA的最低檢測(cè)量均為2.5×104拷貝/μL,敏感性較高。采用uidA基因的PCR方法檢測(cè)了河北省腹瀉致死仔豬臟器分離的101株細(xì)菌,結(jié)果均為大腸桿菌。采用該多重PCR方法和單一P... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020,42(11)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

大腸桿菌uid A基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

使用表1中的引物分別對(duì)5種攜帶不同菌毛基因的標(biāo)準(zhǔn)ETEC基因組DNA進(jìn)行單一PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，5種標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA均擴(kuò)增出了目的條帶，且均與預(yù)期相符（菌毛基因K88、K99、F18ab、F18ac和F41產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為343 bp、157 bp、282 bp、494 bp和580 bp）（圖2）。表明，各引物均能有效擴(kuò)增各大腸桿菌菌毛基因。2.3 多重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

分別以各標(biāo)準(zhǔn)ETEC混合或者單獨(dú)基因組DNA為模板，利用優(yōu)化的多重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，多重PCR可從攜帶K88、K99、F18ab、F18ac和F41菌毛的大腸桿菌混合或者單獨(dú)基因組DNA擴(kuò)增出相應(yīng)目的條帶，但大腸桿菌DH5α、豬源霍亂沙門(mén)氏菌和豬源鏈球菌基因組DNA無(wú)擴(kuò)增（圖4），表明該方法特異性較強(qiáng)。圖4 多重PCR的特異性試驗(yàn)結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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本文編號(hào)：3384121