本研究旨在構建牛纖溶酶原激活物抑制劑1（Plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1）基因真核表達載體、生物信息學分析并對其功能進行初探。實驗參照GenBank數(shù)據(jù)庫公布的牛PAI-1基因的CDS序列信息設計引物,通過RT-PCR獲得PAI-1基因片段,將基因片段與pMD-19-T載體連接轉化DH5α感受態(tài)細胞,構建pMD-19-T-PAI-1克隆載體,雙酶切回收基因片段,構建pcDNA3.1-PAI-1真核表達載體,經(jīng)雙酶切、測序鑒定構建成功。將表達載體轉染至293T細胞,48 h后進行熒光定量PCR（RT-qPCR）和Western Blot檢測PAI-1以及凋亡相關基因Bcl2、Bax和Caspase-3的表達。結果顯示:pcDNA3.1-PAI-1真核表達載體測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫公布的牛PAI-1基因CDS序列完全匹配,生物信息學分析發(fā)現(xiàn)PAI-1基因編碼區(qū)全長1 209 bp,編碼402個氨基酸,存在35個潛在磷酸化位點,主要分布在細胞外。過表達PAI-1可顯著提高293T細胞中PAI-1 mRNA和蛋白表達,抗凋亡基因Bcl2 m... 

【文章來源】：中國畜牧雜志. 2020,56(08)北大核心

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顆粒細胞cDNA PCR產(chǎn)物鑒定

生物信息學分析結果顯示，PAI-1蛋白屬于分泌型蛋白，亞細胞定位顯示主要分布在細胞外，這與其參與凝血功能相一致。總計預測到35個磷酸化位點，而蛋白磷酸化對于細胞信號傳導具有重要作用，說明PAI-1可能參與細胞信號傳導。圖5 PAI-1和凋亡相關基因mRNA相對表達量

牛PAI-1基因編碼氨基酸序列與綿羊、馬、豬、人、狗、大鼠、小鼠PAI-1基因編碼氨基酸序列的同源性分別為95.52%、86.43%、89.55%、85.32%、88.06%、78.86%、76.87%，提示PAI-1基因在不同物種間相對保守。牛PAI-1基因共編碼402個氨基酸，分子式為C2042H3189N539O590S20，分子量為45.37 ku，理論等電點為5.96。如表3所示，PAI-1蛋白共包含20種氨基酸，亮氨酸含量最高，為10.4%，半胱氨酸含量最低，為0.2%，包含44個負電荷氨基酸（天冬氨酸+谷氨酸）和39個正電荷氨基酸（精氨酸+賴氨酸）。2.3.2 磷酸化位點、亞細胞定位分析


本文編號：3372919