小反芻獸疫（Peste des petitus ruminants，PPR）的流行加劇了欠發(fā)達(dá)國(guó)家的貧困，嚴(yán)重影響了動(dòng)物健康與食品安全，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（Food andAgriculture Organization of the UnitedNations, FAO）于2012年提出開(kāi)啟全球范圍的多國(guó)家多地區(qū)全方位合作，從而控制和消滅PPR。然而，小反芻獸疫病毒（Peste des petitus ruminants virus，PPRV）的基礎(chǔ)研究還很薄弱，近年來(lái)PPRV跨地區(qū)跨國(guó)界傳播以及感染野生動(dòng)物，給全球消滅計(jì)劃提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)�；趯�(duì)同屬麻疹病毒（Measles virus, MV）的研究證實(shí)，與受體的相互作用，不僅是病毒入侵宿主的第一步，也是導(dǎo)致宿主機(jī)體組織病理變化分布、宿主呈現(xiàn)臨床癥狀表現(xiàn)的重要原因。下面幾個(gè)問(wèn)題值得關(guān)注：PPRV除了同MV一樣利用SLAM作為受體開(kāi)啟病毒的入侵，是否也同樣利用宿主呼吸道等上皮細(xì)胞基底層的Nectin4分子作為受體從而介導(dǎo)子代病毒的排出？PPRV疫苗株不具備向外“排毒”的特點(diǎn)，是否因?yàn)槠洳荒芘cNectin4結(jié)合？PPRV利用病毒囊膜上的血凝... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文評(píng)閱人、答辯委員會(huì)簽名表
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 綜述
    1.1 PPRV研究進(jìn)展
        1.1.1 形態(tài)學(xué)與基因組結(jié)構(gòu)
        1.1.2 病毒的復(fù)制與毒力
        1.1.3 病毒的進(jìn)化與分型
    1.2 PPR研究進(jìn)展
        1.2.1 臨床癥狀與病理學(xué)研究
        1.2.2 流行與分布
        1.2.3 防控與消滅計(jì)劃
    1.3 MV受體研究進(jìn)展
        1.3.1 MV受體的發(fā)現(xiàn)
        1.3.2 MV-H與各受體作用模式
        1.3.3 MV-H與受體相互作用在病毒復(fù)制中的作用
    1.4 分子模擬技術(shù)研究進(jìn)展
        1.4.1 分子模擬技術(shù)的發(fā)展
        1.4.2 分子模擬技術(shù)在本研究中運(yùn)用的基礎(chǔ)平臺(tái)
        1.4.3 分子模擬的局限與展望
第二章 綿羊Nectin4 基因的克隆與表達(dá)
    摘要
    2.1 材料
        2.1.1 動(dòng)物與組織
        2.1.2 參考序列及引物設(shè)計(jì)軟件
        2.1.3 載體、菌株和細(xì)胞
        2.1.4 主要試劑及酶
        2.1.5 培養(yǎng)基及溶液的配制
    2.2 方法
        2.2.1 綿羊肺支氣管總RNA的提取
        2.2.2 綿羊Nectin4 基因的巢式RT-PCR擴(kuò)增
        2.2.3 PCR產(chǎn)物的T載體克隆
        2.2.4 綿羊Nectin4 基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.5 Nectin4 蛋白的真核表達(dá)
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 綿羊Nectin4 基因第一輪PCR的擴(kuò)增
        2.3.2 綿羊Nectin4 基因第二輪PCR的擴(kuò)增
        2.3.3 陽(yáng)性克隆中Nectin4 基因的擴(kuò)增
        2.3.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Myc-Nectin4 的構(gòu)建與鑒定
        2.3.5 Nectin4 基因表達(dá)的免疫熒光檢測(cè)
        2.3.6 Nectin4 蛋白的Western blotting鑒定
    2.4 討論
第三章 PPRV H-野毒和PPRV H-疫苗的克隆與表達(dá)
    摘要
    3.1 材料
        3.1.1 載體、菌株和細(xì)胞
        3.1.2 主要試劑及酶
        3.1.3 培養(yǎng)基及溶液的配制
    3.2 方法
        3.2.1 PPRV Hw與PPRV Hv全長(zhǎng)的PCR擴(kuò)增
        3.2.2 Hw和Hv基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.3 Hw和Hv蛋白的真核表達(dá)與檢測(cè)
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 PPRV Hw重組質(zhì)粒的構(gòu)建與蛋白表達(dá)
        3.3.2 PPRV Hv重組質(zhì)粒的構(gòu)建與蛋白表達(dá)
    3.4 討論
第四章 同源建模法預(yù)測(cè)PPRV Hw／PPRV Hv與羊源Nectin4／SLAM的相互作用
    摘要
    4.1 材料
        4.1.1 服務(wù)器
        4.1.2 軟件
        4.1.3 序列
    4.2 方法
        4.2.1 復(fù)合物同源建模
        4.2.2 相互作用能計(jì)算
        4.2.3 虛擬氨基酸突變
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 PPRV Hw-羊源SLAM復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析
        4.3.2 PPRV Hv-羊源SLAM復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析
        4.3.3 羊源SLAM分別與PPRV Hw、PPRV Hv相互作用能的比較
        4.3.4 羊源SLAM分別與PPRV Hw、PPRV Hv相互作用關(guān)鍵AA的預(yù)測(cè)
        4.3.5 PPRV Hw-羊源Nectin4 復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析
        4.3.6 PPRV Hv-羊源Nectin4 復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析
        4.3.7 羊源Nectin4 分別與PPRV Hw、PPRV Hv相互作用能的比較
        4.3.8 羊源Nectin4 分別與PPRV Hw、PPRV Hv相互作用關(guān)鍵AA的預(yù)測(cè)
        4.3.9 PPRV Hw分別與羊源SLAM、羊源Nectin4 相互作用的差異
        4.3.10 PPRV Hv分別與羊源SLAM、羊源Nectin4 相互作用的差異
    4.4 討論
第五章 PPRV H與羊源Nectin4 的相互作用
    摘要
    5.1 材料與方法
        5.1.1 動(dòng)物與組織
        5.1.2 病毒、細(xì)胞、菌株和載體
        5.1.3 主要試劑及酶
        5.1.4 培養(yǎng)基及溶液的配制
        5.1.5 PPRV Hw和PPRV Hv胞外區(qū)真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.1.6 羊源Nectin4 胞外區(qū)真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.1.7 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染
        5.1.8 間接免疫熒光
        5.1.9 Western Blotting檢測(cè)
        5.1.10 激光共聚焦觀察定位
        5.1.11 Co-Ip實(shí)驗(yàn)
        5.1.12 病毒感染實(shí)驗(yàn)
        5.1.13 熒光定量PCR檢測(cè)Nectin4 在綿羊各組織中的分布
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 pCDNA3-Flag-bwHw、pCDNA3-Flag-bwHv和pCMV-Myc-bwNectin4c重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
        5.2.2 bwHw、bwHv和bwNectin4 蛋白的表達(dá)
        5.2.3 bwHw與bwNectin4、bwHv與bwNectin4 在CHO細(xì)胞共定位
        5.2.4 PPRV野毒株和疫苗株H蛋白均可與羊源Nectin4 蛋白相互作用
        5.2.5 Nectin4 可提高PPRV在Vero細(xì)胞中的繁殖
        5.2.6 PPRV的組織嗜性與Nectin4 在綿羊的組織分布具有相關(guān)性
    5.3 討論
第六章 PPRV Hw與綿羊Nectin4 相互作用關(guān)鍵區(qū)域和關(guān)鍵氨基酸的鑒定
    摘要
    6.1 材料和方法
        6.1.1 細(xì)胞、菌株和載體
        6.1.2 主要試劑及酶
        6.1.3 相互作用區(qū)域重組質(zhì)粒（pCMV-Myc-zjNectin4）的構(gòu)建
        6.1.4 點(diǎn)突變質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
        6.1.5 pCMV-Myc-zjNectin4 與pCDNA3-Flag-bwHw質(zhì)粒的共表達(dá)
        6.1.6 點(diǎn)突變質(zhì)粒與pCMV-Myc-bwNectin4 質(zhì)粒的共表達(dá)
        6.1.7 激光共聚焦觀察共定位
        6.1.8 Co-Ip實(shí)驗(yàn)
    6.2 結(jié)果
        6.2.1 zjNectin4 能與PPRV Hw相互作用
        6.2.2 五個(gè)PPRV bwHw點(diǎn)突變體均能與bwNectin4 相互作用
    6.3 討論
第七章 H蛋白對(duì)PPRV宿主嗜性影響的分析
    摘要
    7.1 材料和方法
        7.1.1 服務(wù)器
        7.1.2 軟件
        7.1.3 序列
        7.1.4 復(fù)合物同源建模
        7.1.5 相互作用能計(jì)算
        7.1.6 虛擬氨基酸突變
    7.2 結(jié)果
        7.2.1 PPRV Hw/Hv分別與人源SLAM復(fù)合物的構(gòu)建
        7.2.2 PPRV Hw/Hv分別與人源SLAM相互作用能力的分析
        7.2.3 預(yù)測(cè)增強(qiáng)人源SLAM與PPRV Hw/Hv相互作用能力的突變
    7.3 討論
第八章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Rethinking quasispecies theory: From fittest type to cooperative consortia[J]. Luis P Villarreal,Guenther Witzany.  World Journal of Biological Chemistry. 2013(04)
[2]麻疹病毒受體與病毒侵入[J]. 逯光文,高福,嚴(yán)景華.  生物工程學(xué)報(bào). 2013(01)
[3]Evaluation of Efficacy of Stabilizers on the Thermostability of Live Attenuated Thermo-adapted Peste des petits ruminants Vaccines[J]. Thachamvally Riyesh,Vinayagamurthy Balamurugan,Arnab Sen,Veerakyathappa Bhanuprakash,Gnanavel Venkatesan,Vinita Yadav,Raj Kumar Singh.  Virologica Sinica. 2011(05)
[4]小反芻獸疫的研究進(jìn)展[J]. 駱學(xué)農(nóng),鄭亞?wèn)|,才學(xué)鵬.  中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2007(11)

博士論文
[1]小反芻獸疫病毒樣顆粒的裝配與釋放研究[D]. 王秋霞.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2013
[2]小反芻獸疫病毒血凝素蛋白及其受體的研究[D]. 蒙學(xué)蓮.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2012



本文編號(hào)：3367194