小反芻獸疫（peste des petits ruminants,PPR）,俗稱羊瘟,是由小反芻動(dòng)物病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）引起急性、高度傳染性的病毒性疾病,主要發(fā)生于山羊、綿羊和駱駝等反芻動(dòng)物。其病原PPRV是副黏病毒科,麻疹病毒屬的成員。PPRV的基因組大小為15948 nt,編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白和2種非結(jié)構(gòu)蛋白。PPRV在羊源細(xì)胞中難以穩(wěn)定的增殖,導(dǎo)致了PPRV天然免疫和致病機(jī)制方面的研究相對(duì)滯后。宿主限制因子是天然免疫系統(tǒng)的一部分,是宿主進(jìn)化形成的抵抗病原微生物感染的早期防線。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種限制性因子,其中就包括鋅指抗病毒蛋白（Zinc finger antiviral protein,ZAP）。ZAP是由ISG ZC3HAV1基因編碼表達(dá)的一種宿主限制因子,對(duì)多種病毒具有明顯的抑制作用,在天然免疫過程中發(fā)揮了重要作用。目前,關(guān)于羊源ZAP（ovis aries ZAP,oZAP）的抗病毒研究較少,尤其是與PPRV感染之間的關(guān)系尚未見報(bào)道。為此,本論文首先克隆了羊源ZAP,并探索了ZAP在PPRV感染和復(fù)制過程中的作用及... 

【文章來源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：58 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

麻疹病毒基因組和顆粒結(jié)構(gòu)(PFEFFERMANNetal.,2018)

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章羊源ZAP的克隆與序列分析12PCR反應(yīng)體系為：模板DNA（120ng/ul)2.0μL,exTaqMix25μL,上下游引物（10mM)各2μL，加滅菌蒸餾水至50μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃3min;95℃1min,58℃30s,72℃3min,34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，不加模板。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。2.2.3生物信息學(xué)分析利用ExPASy的ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）在線軟件對(duì)oZAP蛋白的理化性質(zhì)分析；利用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）預(yù)測(cè)oZAP基因編碼蛋白的疏水性；分別利用NetPhos3.1Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）和NetNGlyc1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）預(yù)測(cè)oZAP蛋白磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)；分別利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.expasy.org）預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)；利用EMBL-EBL（https://www.embl.org）預(yù)測(cè)oZAP蛋白的功能結(jié)構(gòu)域2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.3.1oZAP基因的獲得從羊脾臟中提取的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖2-1）。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行菌液測(cè)序，得到了為2697bpZAP基因序列，測(cè)序結(jié)果與目的序列一致，同源性達(dá)到100%。圖2-1oZAP基因的PCR擴(kuò)增Fig.2-1PCRamplificationofoZAPgeneM:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1:空白對(duì)照;2:oZAP基因擴(kuò)增產(chǎn)物M:DNAmarker;1.Blankcontrol;2:oZAPgeneamplificationproduct2679bp

彼幔⊿er）含量最高（11.0%），色氨酸（Trp）含量最低（1.3%）。該蛋白在體外理論半衰期為30h，不穩(wěn)定系數(shù)為53.61，為不穩(wěn)定蛋白；總脂肪酸為64.05，親水總平均值為-0.605，屬于親水性蛋白。分別利用SignalP5.0Server和TMHMMServerv.2.0預(yù)測(cè)oZAP蛋白的信號(hào)肽和跨膜區(qū)，結(jié)果如圖2-2A，oZAP蛋白C、Y、S平均值分別為0.193、0.171、0.311及0.194，該蛋白不存在跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)（圖2-2B）。表明oZAP蛋白其不存在信號(hào)肽序列，可以高效表達(dá)。推測(cè)該蛋白可以較高量和可溶性表達(dá)，為獲得可溶性的oZAP蛋白奠基了理論基矗圖2-2oZAP蛋白信號(hào)肽和跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（A）oZAP蛋白信號(hào)結(jié)構(gòu)肽預(yù)測(cè)結(jié)果；（B）oZAP蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.2-2PredictionofoZAPproteinsignalpeptideandthetransmembranestructure(A)PredictionresultsofoZAPproteinsignalstructurepeptide;(B)PredictionresultsofoZAPproteintransmembranestructure運(yùn)用NetPhos3.1Server和NetNGlyc1.0軟件分別預(yù)測(cè)oZAP蛋白磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)，結(jié)果顯示，當(dāng)潛在磷酸化位點(diǎn)的閾值為0.5時(shí)，oZAP蛋白存在114個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，其中包括77個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、6個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)和12個(gè)酪氨酸位點(diǎn)（圖2-3A）。oZAP蛋白含有5個(gè)糖基化位點(diǎn)，NGSA、NHSD、NDSV、NISF、NPSV分別為0.7017、0.5367、0.5439、0.6350、0.6106（圖2-3B）。蛋白質(zhì)在翻譯后會(huì)經(jīng)過適當(dāng)?shù)男揎椥纬沙墒斓鞍踪|(zhì)，其中磷酸化和糖基化是自然界中重要的翻譯后修飾。經(jīng)過生物信息學(xué)分析，oZAP蛋白的5個(gè)糖基化位點(diǎn)可能對(duì)其功能具有重要作用。AB


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