為建立一種快速、敏感和特異性檢測(cè)新型鴨呼腸孤病毒（novel duck reovirus,NDRV）的方法,本研究根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中NDRV S3基因保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物和1條MGB熒光探針,建立了一種檢測(cè)NDRV的一步法MGB熒光定量RT-PCR方法,對(duì)其特異性、敏感性和重復(fù)性進(jìn)行檢驗(yàn),并與普通RT-PCR進(jìn)行比較。結(jié)果顯示,擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.999,擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線僅出現(xiàn)單特異峰。該方法對(duì)經(jīng)典鴨呼腸孤病毒、H9N2禽流感病毒、鴨坦布蘇病毒、A型鴨肝炎病毒、鴨新城疫病毒、鴨瘟病毒及番鴨細(xì)小病毒均未檢測(cè)到信號(hào),對(duì)NDRV的最小檢出量為10拷貝·μL^-1。組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2%,重復(fù)性好。此外,利用該方法對(duì)239份疑似新型呼腸孤病毒病樣品進(jìn)行檢測(cè),常規(guī)RT-PCR檢測(cè)時(shí)有75份為陽(yáng)性,一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)時(shí)有100份為陽(yáng)性,而且常規(guī)RT-PCR檢測(cè)出的陽(yáng)性樣品用一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR檢測(cè)時(shí)均為陽(yáng)性,符合率為100%。該檢測(cè)方法的建立為NDRV早期快速檢測(cè)及定量分析提供新的方法。 

【文章來(lái)源】：浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2020,32(04)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【部分圖文】：

NDRV一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR擴(kuò)增曲線(A)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(B)

采用建立的一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR方法對(duì)臨床采集的239份疑似病例樣品(肝臟、脾臟)進(jìn)行檢測(cè),并與常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行比較。結(jié)果顯示,常規(guī)RT-PCR檢測(cè)239份樣品時(shí)有75份為陽(yáng)性,一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)時(shí)有100份為陽(yáng)性,而且常規(guī)RT-PCR檢測(cè)出的陽(yáng)性樣品用一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR檢測(cè)時(shí)均為陽(yáng)性,符合率為100%。圖3 NDRV一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR特異性試驗(yàn)

圖2 NDRV一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR敏感性試驗(yàn)表1 一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)Table 1 Intra assay and inter assay reproducibility of one-step real-time TaqMan-MGB RT-PCR RNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度Concentration of standard (copies·μL-1) 組內(nèi)變異實(shí)驗(yàn) Inter-assay variability 組間變異實(shí)驗(yàn) Intra-assay variability 平均數(shù) Mean±SD 變異系數(shù) CV/% 平均數(shù) Mean±SD 變異系數(shù) CV/% 1×108 14.89±0.066 0.44 14.99±0.127 0.85 1×107 17.98±0.146 0.81 17.92±0.265 1.48 1×106 21.84±0.163 0.75 21.81±0.198 0.91 1×105 24.93±0.181 0.73 24.81±0.272 1.10 1×104 28.32±0.187 0.66 27.98±0.447 1.60

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]鴨呼腸孤病毒基因Ⅰ型與Ⅱ型鑒別診斷RT-PCR方法的建立與應(yīng)用[J]. 云濤,張存,華炯鋼,余斌,葉偉成,陳柳,倪征.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2016(12)
[2]一種新型鴨呼腸孤病毒SYBR GreenⅡ熒光定量PCR方法的建立[J]. 丁明洋,戚偉強(qiáng),陳宗艷,朱杰,吳巧梅,繆秋紅,李傳峰,吳潤(rùn),劉光清.  中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào). 2016(01)
[3]新型鴨呼腸孤病毒SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 袁遠(yuǎn)華,吳志新,王俊峰,黃興國(guó),賀東生,黃淑堅(jiān).  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2013(09)
[4]新型鴨呼腸孤病毒的分離與鑒定[J]. 陳少鶯,陳仕龍,林鋒強(qiáng),王劭,江斌,程曉霞,朱小麗,李兆龍.  病毒學(xué)報(bào). 2012(03)
[5]一種番鴨“新肝病”在浙江的流行特點(diǎn)分析[J]. 陸新浩,劉鴻,陳秋英,任祖伊,黃建勇,吳勇.  中國(guó)家禽. 2011(15)
[6]3種禽類呼腸孤病毒血清學(xué)相關(guān)性及致細(xì)胞病變差異分析[J]. 陳仕龍,陳少鶯,程曉霞,江斌,林鋒強(qiáng),王劭,朱小麗,李兆龍,張世忠.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2011(04)
[7]新致病型鴨呼腸孤病毒的分離鑒定[J]. 黃瑜,傅光華,施少華,萬(wàn)春和,程龍飛,江斌,陳紅梅,林芳,林建生,張大丙.  中國(guó)獸醫(yī)雜志. 2009(12)
[8]一株鵝源呼腸孤病毒的分離與鑒定[J]. 王光鋒,王永坤,王建業(yè),朱國(guó)強(qiáng),嚴(yán)維巍,周繼宏,莊國(guó)宏,錢鐘.  中國(guó)家禽. 2003(15)
[9]番鴨呼腸孤病毒的分離與鑒定[J]. 吳寶成,陳家祥,姚金水,陳枝華,陳文列,李國(guó)平,曾顯成.  福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2001(02)



本文編號(hào)：3349100