為建立一種快速、敏感和特異性檢測新型鴨呼腸孤病毒（novel duck reovirus,NDRV）的方法,本研究根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中NDRV S3基因保守序列設(shè)計1對特異性引物和1條MGB熒光探針,建立了一種檢測NDRV的一步法MGB熒光定量RT-PCR方法,對其特異性、敏感性和重復(fù)性進行檢驗,并與普通RT-PCR進行比較。結(jié)果顯示,擴增標準曲線相關(guān)系數(shù)為0.999,擴增產(chǎn)物的熔解曲線僅出現(xiàn)單特異峰。該方法對經(jīng)典鴨呼腸孤病毒、H9N2禽流感病毒、鴨坦布蘇病毒、A型鴨肝炎病毒、鴨新城疫病毒、鴨瘟病毒及番鴨細小病毒均未檢測到信號,對NDRV的最小檢出量為10拷貝·μL^-1。組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2%,重復(fù)性好。此外,利用該方法對239份疑似新型呼腸孤病毒病樣品進行檢測,常規(guī)RT-PCR檢測時有75份為陽性,一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR方法檢測時有100份為陽性,而且常規(guī)RT-PCR檢測出的陽性樣品用一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR檢測時均為陽性,符合率為100%。該檢測方法的建立為NDRV早期快速檢測及定量分析提供新的方法。 

【文章來源】：浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2020,32(04)北大核心CSCD

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NDRV一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR擴增曲線(A)和標準曲線(B)

采用建立的一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR方法對臨床采集的239份疑似病例樣品(肝臟、脾臟)進行檢測,并與常規(guī)RT-PCR方法進行比較。結(jié)果顯示,常規(guī)RT-PCR檢測239份樣品時有75份為陽性,一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR方法檢測時有100份為陽性,而且常規(guī)RT-PCR檢測出的陽性樣品用一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR檢測時均為陽性,符合率為100%。圖3 NDRV一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR特異性試驗

圖2 NDRV一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR敏感性試驗表1 一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗Table 1 Intra assay and inter assay reproducibility of one-step real-time TaqMan-MGB RT-PCR RNA標準品濃度Concentration of standard (copies·μL-1) 組內(nèi)變異實驗 Inter-assay variability 組間變異實驗 Intra-assay variability 平均數(shù) Mean±SD 變異系數(shù) CV/% 平均數(shù) Mean±SD 變異系數(shù) CV/% 1×108 14.89±0.066 0.44 14.99±0.127 0.85 1×107 17.98±0.146 0.81 17.92±0.265 1.48 1×106 21.84±0.163 0.75 21.81±0.198 0.91 1×105 24.93±0.181 0.73 24.81±0.272 1.10 1×104 28.32±0.187 0.66 27.98±0.447 1.60

【參考文獻】：
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本文編號：3349100