RNA結(jié)合基序蛋白3（RNA binding motif protein 3,RBM3）是Danno等于1997年首次在人類胎兒的腦組織中分離鑒定得到的一種富含甘氨酸的冷休克蛋白。RBM3蛋白是一種具有潛在研究價(jià)值的多功能蛋白質(zhì),它不僅能夠在對(duì)抗缺氧、寒冷等有害刺激時(shí)提升表達(dá)量以保護(hù)細(xì)胞,而且它在預(yù)防腫瘤、癌癥的發(fā)生和肌肉疾病的治療上都具有開發(fā)價(jià)值。因此構(gòu)建能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的含有RBM3基因的慢病毒表達(dá)載體能夠?yàn)檠芯縍BM3蛋白的生理作用機(jī)制及RBM3蛋白在臨床上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)的目的是應(yīng)用分子生物學(xué)手段構(gòu)建含有仔豬RNA結(jié)合基序蛋白3（RBM3）基因的慢病毒表達(dá)載體pLenti6/v5-RBM3,通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)讓重組的慢病毒質(zhì)粒進(jìn)入293T細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)毒,用產(chǎn)生的重組慢病毒液感染ST細(xì)胞（豬睪丸細(xì)胞系）,應(yīng)用熒光定量PCR方法和Western blot方法從mRNA水平和蛋白水平評(píng)價(jià)重組慢病毒載體提高RBM3蛋白表達(dá)的效果。本研究主要應(yīng)用生物學(xué)手段擴(kuò)增得到仔豬RBM3基因,然后將其連入入門載體pENTR-11中,應(yīng)用Gateway技術(shù)將RBM3基因平行轉(zhuǎn)移到慢病毒載體pLenti... 

【文章來源】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)黑龍江省

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

仔豬脾臟組織總RNA提取結(jié)果

RBM3 基因的擴(kuò)增及連有 RBM3 基因 T 載體的mplification of RBM3 and the evaluation of the T脾臟組織中 RBM3 基因的 RT-PCR 檢測結(jié)果.2: 檢測結(jié)果.4: PCR 鑒定的空白對(duì)照組. 5: 連接 R結(jié)果.6: 酶切鑒定的空白對(duì)照組.-PCR result of RBM3 expression in spleen tissue oor containing RBM3. 4: blank group of PCR. 5: thor containing RBM3. 6: blank group of double dig結(jié)果如下：GGAAGCTCTTCGTGGGAGGGCTCAACATCAGCAGTTTCAGACCTATTTCTGGCGATCCCGGGGTTTTGGCTTCATTACGAGAGCCATGAATGGAGAGTCTCTGAAGTCGGCCCAGGGAACAAGAAGGAGAGGTGGAGGGGAGCAGGGCTCTGATGTCTACAGATATGGATATGGAAAG

鑒定以重組入門載體 pENTR-RBM3 為模板進(jìn)行 PCR 反應(yīng),鑒定得到 551 bp 的 DNA 片段(圖2-3) ，未見非特異性片段。將重組入門載體 pENTR-RBM3 進(jìn)行雙酶切, 得到 2300 bp 和 551bp 的 DNA 片段(圖 2-3)。圖 2-3 重組載體 pENTR-RBM3 的鑒定結(jié)果Fig.2-3 The evaluation of the recombinant vector pENTR-RBM3M: DL 2000 Marker.1: 重組載體 pENTR-RBM3 的 PCR 檢測結(jié)果.2: PCR 鑒定的空白對(duì)照組. 3: 重組載體pENTR-RBM3 的酶切檢測結(jié)果.4: 酶切鑒定的空白對(duì)照組.M: DL 2000 Marker. 1: the PCR result of the recombinant vector pENTR-RBM3. 2: blank group of PCR. 3: thedouble digestion result of the recombinant vector pENTR-RBM3. 4: blank group of double digestion.2.3.5 重組慢病毒載體的鑒定以重組慢病毒載體 pLenti6/v5-RBM3 為模板進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，鑒定得到 551 bp 的 DNA片段(圖 2-4)。 將重組慢病毒載體 pLenti6/v5-RBM3 進(jìn)行雙酶切，得到 8688 bp 和 551 bp 的DNA 片段(圖 2-4)。

【參考文獻(xiàn)】：
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