鵝卵黃性腹膜炎,是主要發(fā)生于產(chǎn)蛋種鵝的一種急性傳染病,產(chǎn)蛋母鵝會因為該病的發(fā)生出現(xiàn)生產(chǎn)性能下降、絕產(chǎn)甚至死亡,從而對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。外膜蛋白A是廣泛存在于革蘭氏陰性腸桿菌外膜上的蛋白,N端具有21個氨基酸的信號肽序列。OmpA又稱為熱修飾蛋白,是細菌的抗宿主殺傷因子,同時作為微孔蛋白能夠維持細菌外膜結(jié)構(gòu)的完整以及細菌的正常形態(tài),同時也是細菌重要的毒力因子,在細菌的粘附和侵襲的起始過程中都起著關鍵作用。目前對于該病的防治主要是依賴于抗生素,但是隨著集約化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展以及抗生素治療的廣泛應用,細菌的耐藥性也隨之增加,多種抗生素的共同使用造成的抗生素殘留同時也危害著人類的健康。1.致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌外膜蛋白A的克隆表達以致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌分離株G8107菌株基因組DNA為模板,用PCR法擴增ompA基因,PCR產(chǎn)物用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切,酶切產(chǎn)物回收與相同黏性末端的表達載體pET-32a（+）連接構(gòu)建表達ompA的重組質(zhì)粒,將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達宿主菌BL21（DE3）,抽提質(zhì)粒,酶切鑒定及測序正確后誘導表達。對轉(zhuǎn)化菌株以IPTG進行誘導后,裂解細菌,離心,上清進行... 

【文章來源】：揚州大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
符號說明
文獻綜述
    1. 鵝卵黃性腹膜炎
        1.1 病原學
        1.2 流行病學
        1.3 診斷和防治
    2. 致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌OmpA
        2.1 OmpA的基本結(jié)構(gòu)和功能
        2.2 OmpA的研究進展
    3. Red/ET同源重組技術
        3.1 Red/ET重組系統(tǒng)的作用機制
        3.2 Red/ET重組系統(tǒng)相關質(zhì)粒
        3.3 Red/ET重組技術的應用展望
    參考文獻
研究一 致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌外膜蛋白A的克隆表達
    摘要
    1 材料與方法
        1.1 菌種與載體
        1.2 試劑與培養(yǎng)基
        1.3 引物設計及合成
        1.4 PCR擴增目的基因
        1.5 目的基因ompA的克隆及測序
        1.6 OmpA融合蛋白的表達及最佳表達條件摸索
        1.7 His-OmpA蛋白的純化
    2. 結(jié)果與分析
        2.1 ompA片段的PCR擴增結(jié)果
        2.2 目的片段和表達載體的酶切結(jié)果
        2.3 重組質(zhì)粒pET-32a-ompA的酶切鑒定
        2.4 OmpA重組質(zhì)粒表達條件摸索結(jié)果
        2.5 His-OmpA蛋白純化后的SDS-PAGE
    3. 討論
研究二 抗致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌外膜蛋白A單克隆抗體的制備
    摘要
    1 材料與方法
        1.1 免疫原、細胞及實驗動物
        1.2 試劑
        1.3 主要儀器
        1.4 動物免疫
        1.5 篩選最適包被抗原量確定
        1.6 細胞融合
        1.7 陽性雜交瘤細胞的篩選
        1.8 單克隆抗體的亞類鑒定
        1.9 腹水的制備及單抗效價的測定
        1.10 單克隆抗體特異性的鑒定
        1.11 Western-blot驗證OmpA在細菌中的分布情況
    2. 結(jié)果與分析
        2.1 單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立
        2.2 單克隆抗體特異性的鑒定結(jié)果
        2.3 抗OmpA單克隆抗體的亞類鑒定結(jié)果
        2.4 抗OmpA單克隆抗體的效價測定及腹水的特異性鑒定
        2.5 Western-blot驗證OmpA在細菌中的分布情況
    3. 討論
研究三 致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌外膜蛋白A基因缺失株的構(gòu)建及其相關功能分析
    摘要
    1 材料與方法
        1.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)基
        1.2 主要儀器和引物
        1.3 引物設計
        1.4 50bp同源臂FRT卡那霉素抗性片段的擴增及回收
        1.5 pRedET質(zhì)粒及含同源臂抗性片段的電轉(zhuǎn)化
        1.6 AompA菌的鑒定
        1.7 ΔompA G8107大腸桿菌與G8107大腸桿菌生物學特性對比
        1.8 動物實驗
    2. 結(jié)果與分析
        2.1 含50bp同源臂FRT卡那霉素抗性片段PCR擴增
        2.2 ompA基因缺失G8107大腸桿菌菌株的鑒定
        2.3 ΔompA G8107大腸桿菌生物學特性鑒定
        2.4 動物實驗
    3. 討論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]雞腸炎沙門氏菌ompA基因的克隆與表達[J]. 余波,徐景峨,王璇,譚詩文.  中國畜牧獸醫(yī). 2012(12)
[2]大腸桿菌外膜蛋白A研究進展[J]. 宋舟,陳偉,張立艷,董海兵,白換力,付本懂,申海清,韋旭斌.  中國畜牧獸醫(yī). 2012(05)
[3]單克隆抗體研究進展[J]. 劉萍,陳苗苗,劉學榮,牟克斌,黃銀君.  中國畜牧獸醫(yī). 2012(01)
[4]大腸桿菌外膜蛋白A在原核表達載體中的克隆表達[J]. 呼銳,佟春玉,崔玉東.  黑龍江八一農(nóng)墾大學學報. 2011(01)
[5]種鵝“蛋子瘟”的診斷與防治[J]. 李春江,張培文,單既智,王春華.  水禽世界. 2009(06)
[6]母鵝卵黃性腹膜炎的發(fā)生及防治[J]. 吳立芬.  現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技. 2009(13)
[7]Red重組系統(tǒng)用于大腸桿菌基因修飾研究進展[J]. 張雪,溫廷益.  中國生物工程雜志. 2008(12)
[8]生物技術和藥物研究進展[J]. 劉兢.  中國科學技術大學學報. 2008(08)
[9]鴨疫里默氏桿菌OmpA基因的克隆與表達[J]. 周祖濤,陳芬芬,李自力,胡思順,孫淑娜,吳仁蔚,肖運才,許青榮,畢丁仁.  中國獸醫(yī)學報. 2008(01)
[10]鵝大腸桿菌性腹膜炎的發(fā)生及其綜合防制[J]. 敖禮林,曾秋生,陳彬,余定達.  農(nóng)村實用科技信息. 2006(03)

碩士論文
[1]致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌相關特異蛋白的鑒定及其單克隆抗體的研制[D]. 張勇攀.揚州大學 2012
[2]致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌cya、crp雙基因缺失突變株的構(gòu)建及其相關功能性分析[D]. 王鍇.揚州大學 2010



本文編號：3344883