【目的】分析牛乳腺中7種主要乳蛋白基因密碼子使用偏好性,篩選高頻密碼子和低頻密碼子,依據(jù)其對人溶菌酶基因進(jìn)行密碼子局部優(yōu)化和全局優(yōu)化,通過牛乳腺上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞對優(yōu)化效果進(jìn)行分析評價,為提高重組人溶菌酶表達(dá)量,開發(fā)新型、高效、安全的重組人溶菌酶提供理論依據(jù)�！痉椒ā坷肅odonW和EMBOSS等軟件對7種主要牛乳蛋白和人溶菌酶基因密碼子偏好進(jìn)行生物信息學(xué)分析,篩選牛乳蛋白基因高頻、低頻密碼子并根據(jù)牛乳蛋白基因密碼子使用偏好對人溶菌酶基因翻譯起始區(qū)前22位密碼子（LYZop22）和全局密碼子（LYZop）分別進(jìn)行優(yōu)化。構(gòu)建人溶菌酶-熒光素酶融合表達(dá)載體（pGL3-LYZcw/op22/op）和人溶菌酶過表達(dá)載體（pcDNA-LYZcw/op22/op）,將上述載體分別轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細(xì)胞（BMEC）、牛成纖維細(xì)胞（BFFC）和C127小鼠乳腺上皮細(xì)胞等3種細(xì)胞,通過熒光素酶、實時熒光定量PCR及Western-blot等方法檢測密碼子優(yōu)化對溶菌酶表達(dá)的影響�！窘Y(jié)果】牛乳蛋白基因密碼子偏好以GC結(jié)尾,GC3s平均含量為0.537±0.062,而人溶菌酶GC3s含量為0.407,偏好以AT... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2020,53(18)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：13 頁

【部分圖文】：

牛乳蛋白及人溶菌酶基因密碼子使用RSCU值聚類分析

CodonW比較優(yōu)化前后序列，結(jié)果表明，LYZcw、LYZop22、LYZop第三位堿基即GC3s含量分別為0.407、0.450、0.757。m RNA二級結(jié)構(gòu)最小自由能MFE從-138.83 kcal/mol(LYZcw）分別降低到了-141.02kcal/mol(LYZop22）和-178.12 kcal/mol(LYZop),m RNA二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性明顯提高。對m RNA翻譯起始區(qū)100個堿基進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)相比于LYZcw(-29.7 kcal/mol),LYZop22(-26.4 kcal/mol）和LYZop(-31.0 kcal/mol）密碼子優(yōu)化并沒有明顯改變翻譯起始區(qū)二級結(jié)構(gòu)最小自由能，相反在5′端引入了更多的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（圖3），有利于核糖體與m RNA的結(jié)合并啟動翻譯。2.5 人溶菌酶-熒光素融合載體構(gòu)建及溶菌酶表達(dá)分析

電泳和測序結(jié)果表明，成功克隆到了人溶菌酶野生型LYZcw、翻譯起始區(qū)密碼子優(yōu)化的LYZop22 CDS區(qū)序列及全基因合成的全局密碼子優(yōu)化的LYZop CDS區(qū)序列，且與預(yù)期序列信息一致（圖4）。Nco1酶切和測序結(jié)果表明，成功構(gòu)建了pGL3-LYZcw/op22/op 3個人溶菌酶-熒光素酶融合表達(dá)載體，且LYZcw、LYZop22、LYZop編碼區(qū)與螢火蟲熒光素酶基因正確融合，沒有移碼突變（圖5）。圖5 pGL3-LYZcw/op22/op載體Nco1酶切鑒定

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)人溶菌酶基因（hLYZ）牛胚胎的研究[J]. 熊顯榮,李文哲,王麗君,王勇勝,蘇建民,華松,張涌.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報. 2011(02)
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本文編號：3343991