【目的】分離并鑒定新疆羊種布魯氏菌。原核表達(dá)該菌的L7/L12蛋白,檢測該蛋白的反應(yīng)原性及進(jìn)行部分生物學(xué)分析�！痉椒ā坎捎眉�(xì)菌劃線培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、PCR檢測以及生化試驗(yàn)進(jìn)行布魯氏菌分離鑒定。利用常規(guī)分子生物學(xué)方法表達(dá)并純化羊種布魯氏菌分離株的L7/L12蛋白,應(yīng)用Western Blot分析融合蛋白的反應(yīng)原性。使用生物信息學(xué)軟件對該蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析�！窘Y(jié)果】分離鑒定確定該菌株為羊種布魯氏菌。經(jīng)過測序與酶切鑒定,正確構(gòu)建了表達(dá)載體p ET-28a-L7/L12.SDS-PAGE試驗(yàn)顯示純化的L7/L12蛋白為單一條帶;經(jīng)過Western Blot檢測,該融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性。生物信息學(xué)分析顯示,該蛋白無跨膜區(qū)結(jié)構(gòu),不存在信號(hào)肽,二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋為主并利用Phyre2服務(wù)器成功構(gòu)建了該蛋白的三維模型。【結(jié)論】鑒定出該分離菌株,表達(dá)并純化了該菌的L7/L12融合蛋白,Western Blot證明該蛋白具有良好的反應(yīng)原性,為后續(xù)該蛋白的亞單位疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：新疆農(nóng)業(yè)科學(xué). 2017,54(03)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

7/L12基因的擴(kuò)增

晰，雜帶較少，說明純化效果較好(圖5b)。圖52．7重組蛋白L7/L12的反應(yīng)原性檢測將純化后的重組蛋白L7/L12轉(zhuǎn)至NC膜，采用羊布魯菌陽性血清作為一抗，HＲP標(biāo)記的兔抗羊抗體為二抗進(jìn)行免疫印跡分析。WesternBlot結(jié)果顯示在19ku的位置上有一條明顯的特異性反應(yīng)條帶，表明融合蛋白能被抗布魯氏菌的綿羊血清所識(shí)別，且目的蛋白具有良好的反應(yīng)原性，與理論分析相符合。圖61－2:純化后的L7/L12蛋白;M:蛋白MarkerSDS－PAGEa-nalysistheeffectofpurifiedL7/L12fusionprotein1－2:thepurifiedL7/L12protein;M:ProteinMarker圖5SDS－PAGE電泳檢測L7/L12融合蛋白純化效果Fig．5SDS－PAGEanalysistheeffectofpurifiedL7/L12fusionprotein1－3:純化的His－L7/L12融合蛋白;M:蛋白Marker1－3:thepurifiedHis－L7/L12fusionprotein;M:ProteinMarker圖6融合蛋白His－L7/L12WesternBlot分析Fig．6TheWesternBlotanalysisoffusionproteinHis－L7/L122．8目的蛋白的生物信息學(xué)通過TMHMMServerv．2.0在線軟件分析得568

3期劉升等:新疆羊種布魯氏菌分離株的鑒定與L7/L12蛋白的原核表達(dá)和生物信息學(xué)分析出，目的蛋白無跨膜螺旋結(jié)構(gòu)(圖7)。SignalP4.1Server對該蛋白氨基酸序列分析顯示，該蛋白有信號(hào)肽(圖8)。利用SOPMA在線軟件分析該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，85個(gè)氨基酸參與形成α－螺旋，占68.55%。延伸鏈占8.87%，有13個(gè)氨基酸參與形成β－折疊，占10.48%，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)占12.10%(圖9)。通過Phyre2在線服務(wù)器構(gòu)建出并優(yōu)化目的蛋白的三維結(jié)構(gòu)(圖10)。利用PDBsumGenerate在線評(píng)估(圖11)。從Ｒa-machandran圖中可以看出，在121個(gè)氨基酸殘基中，有98個(gè)處于核心允許區(qū)，占92.5%，6個(gè)處于額外允許區(qū)，占5.7%，1個(gè)處于最大允許區(qū)，占0.9%，不可信區(qū)域?yàn)?，占0.9%。這說明該模型具有一定的可信度。圖7～11圖7TMHMMServerv．2.0預(yù)測L7/L12蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域Fig．7ThepredictionoftransmembranedomainofL7/L12proteinbyTMHMMServerv．2.0圖8SignalP4.1Server預(yù)測L7/L12蛋白信號(hào)肽Fig．8ThepredictionofsignalpeptideofL7/L12proteinbySignalP4.1Server569

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]新疆布魯氏菌病疫情現(xiàn)狀與防治對策[J]. 任德坤,常青,師茂林,李凡卡.  地方病通報(bào). 2008(05)
[3]中國布魯氏菌病疫情監(jiān)測與控制[J]. 崔步云.  疾病監(jiān)測. 2007(10)
[4]布魯氏菌病再度肆虐及其原因[J]. 尚德秋.  中國地方病防治雜志. 2001(01)

博士論文
[1]流產(chǎn)布魯氏菌Omp25與L7/L12促巨噬細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制[D]. 曹滌非.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012



本文編號(hào)：3335582