比格犬廣泛應(yīng)用于國(guó)家二類以上新藥研發(fā)，但比格犬在繁殖方面出現(xiàn)了不發(fā)情、發(fā)情不孕、休情期長(zhǎng)、窩產(chǎn)仔數(shù)減少等現(xiàn)象，為了探討該犬繁殖性能降低的機(jī)理，本研究對(duì)ERβ剪切異構(gòu)體的蛋白定位及其生物學(xué)功能進(jìn)行研究。通過構(gòu)建ERβ剪切異構(gòu)體重組真核表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，檢測(cè)目的蛋白在體外細(xì)胞表達(dá)及定位情況；建立穩(wěn)定表達(dá)ERβ剪切異構(gòu)體細(xì)胞系；構(gòu)建針對(duì)目的基因慢病毒介導(dǎo)RNA干涉表達(dá)載體，利用熒光定量PCR方法和Western Blot方法在mRNA水平和蛋白水平上檢測(cè)對(duì)目的基因干涉效果。結(jié)果表明：成功構(gòu)建比格犬ERβ剪切異構(gòu)體MYC標(biāo)簽重組真核表達(dá)載體，WB結(jié)果顯示，ERβ1293編碼430aa，蛋白量大小為48kDa；ERβ1257編碼419aa，蛋白量大小為47kDa；體外細(xì)胞蛋白定位結(jié)果表明，ERβ1293主要定位于細(xì)胞質(zhì)，而ERβ1257均主要定位于細(xì)胞核；成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)ERβ1293和ERβ1257細(xì)胞株，WB結(jié)果表明目的基因得到高效的表達(dá)；分別針對(duì)兩條ERβ剪切異構(gòu)mRNA，各構(gòu)建三條shRNA序列及一條shNC，并合成于慢病毒載體。qRT-PCR方法從mRNA水平檢測(cè)干... 

【文章來源】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)黑龍江省

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

ERs結(jié)構(gòu)示意圖

二章 比格犬 ERβ 剪切異構(gòu)體體外細(xì)胞蛋白定位1290、pEGFP-N1-ERβ1254 重組真核表達(dá)載酶，成功克隆 ERβ1293、ERβ1257（均含糖凝膠電泳 DNAMarker 2 000 位置比對(duì)，克隆陽性菌液經(jīng)測(cè)序比對(duì)，均與比格犬 ER突變，可用于后續(xù)的重組表達(dá)載體的構(gòu)建電泳圖。M1 2

Rβ1257 重組質(zhì)粒的測(cè)序兩條 ERβ 基因剪切異構(gòu)體 ERβ1293 和 ERβ12基或氨基酸突變，可用于真核表達(dá)實(shí)驗(yàn)。t 鑒定 ERβ1293、ERβ1257 MYC 標(biāo)簽重組質(zhì)粒顯示：檢測(cè)到目的蛋白在 HEK293T 細(xì)胞中瞬列 3 和 4）MYC 標(biāo)簽融合蛋白分子量分別為 49kDa，證明 ERβ1293 和 ERβ1257 MYC 標(biāo)簽重簽白1 2 3 4 5 6 7 8 2.4 重組質(zhì)粒 XhoI 和 BamHI 雙酶切鑒定結(jié)果3：pcDNA3.1-MYC-ERβ1293；4~6：pcDNA3 Results of Recombinant Plasmids to Check with~3：pcDNA3.1-MYC-ERβ1293；4~6：pcDNA

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3334606