發(fā)布時(shí)間：2021-08-08 23:05

　　本研究旨在利用堿基編輯器在巴馬豬胎兒成纖維細(xì)胞（porcine fetal fibroblast cells,PFFs）中對(duì)生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因胰島素樣生長(zhǎng)因子2（insulin-like growth factor 2,IGF2）進(jìn)行高效、精確的定點(diǎn)編輯。通過PCR擴(kuò)增和測(cè)序?qū)Π婉R豬和大白豬的IGF2基因序列進(jìn)行鑒定,構(gòu)建靶向巴馬豬的sgRNA-IGF2表達(dá)載體,進(jìn)而通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染、混合細(xì)胞編輯效率檢測(cè)、單克隆細(xì)胞篩選及基因型鑒定等技術(shù)手段研究不同堿基編輯器對(duì)豬IGF2基因靶點(diǎn)的編輯效率及突變類型。結(jié)果顯示,巴馬豬和大白豬IGF2基因第3內(nèi)含子存在第3 072 bp處的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn),設(shè)計(jì)靶向巴馬豬IGF2基因的單鏈寡核苷酸序列。單鏈寡核苷酸經(jīng)退火后與BsaⅠ線性化的pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒進(jìn)行重組連接,構(gòu)建sgRNA-IGF2表達(dá)質(zhì)粒,重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果表明,sgRNA序列已經(jīng)精確連入U(xiǎn)6啟動(dòng)子和sgRNA骨架之間。將rA1-BE3、hA3A-BE3、hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F 4種胞嘧啶堿基編輯器分別與sgRNA-IGF2表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染... 

【文章來源】：中國(guó)畜牧獸醫(yī). 2020,47(11)北大核心

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

sgRNA-IGF2表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果

本研究共使用rA1-BE3、hA3A-BE3、hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F 4種胞嘧啶堿基編輯器[6](圖1)。在傳統(tǒng)的rA1-BE3中,rA1、Cas9和UGI三者之間通過連接肽進(jìn)行串聯(lián),并利用CMV啟動(dòng)子表達(dá)該融合蛋白。hA3A-BE3使用人源胞嘧啶脫氨酶hA3A替換rA1;hA3A-BE3-Y130F的hA3A中存在第130位的酪氨酸(Tyr)到苯丙氨酸(Phe)的氨基酸突變;hA3A-eBE-Y130F相對(duì)于hA3A-BE3-Y130F,利用P2A融合肽,額外表達(dá)3個(gè)游離的UGI。1.1.2 主要試劑

pGL3-U6-sgRNA載體包含U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄表達(dá)的sgRNA骨架,通過將Bsa Ⅰ線性化的pGL3-U6-sgRNA載體與靶向巴馬豬IGF2基因的sgRNA Oligo進(jìn)行重組,對(duì)構(gòu)建的sgRNA-IGF2質(zhì)粒進(jìn)行Sanger測(cè)序,結(jié)果顯示,sgRNA序列已經(jīng)精確連入U(xiǎn)6啟動(dòng)子和sgRNA骨架之間(圖4)。圖3 IGF2基因位點(diǎn)堿基編輯示意圖

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Base editing in pigs for precision breeding[J]. Ruigao SONG,Yu WANG,Yanfang WANG,Jianguo ZHAO.  Frontiers of Agricultural Science and Engineering. 2020(02)
[2]CRISPR/Cas9技術(shù)及其在豬基因編輯中的應(yīng)用[J]. 劉思遠(yuǎn),盧丹,唐中林.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020(03)
[3]單堿基水平上胞嘧啶堿基編輯器（CBE）的研究進(jìn)展[J]. 李廣棟,張魯,富俊才,連正興,劉國(guó)世.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020(01)
[4]堿基編輯系統(tǒng)研究進(jìn)展[J]. 宗媛,高彩霞.  遺傳. 2019(09)
[5]基因組編輯技術(shù)在豬遺傳改良中的應(yīng)用[J]. 黃嬌嬌,曹春偉,鄭國(guó)民,趙建國(guó).  遺傳. 2017(11)
[6]單堿基基因編輯系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 劉佳慧,梁普平,時(shí)光,黃軍就.  世界科技研究與發(fā)展. 2017(06)



本文編號(hào)：3330851