本研究旨在利用堿基編輯器在巴馬豬胎兒成纖維細(xì)胞（porcine fetal fibroblast cells,PFFs）中對生長性狀相關(guān)基因胰島素樣生長因子2（insulin-like growth factor 2,IGF2）進(jìn)行高效、精確的定點(diǎn)編輯。通過PCR擴(kuò)增和測序?qū)Π婉R豬和大白豬的IGF2基因序列進(jìn)行鑒定,構(gòu)建靶向巴馬豬的sgRNA-IGF2表達(dá)載體,進(jìn)而通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染、混合細(xì)胞編輯效率檢測、單克隆細(xì)胞篩選及基因型鑒定等技術(shù)手段研究不同堿基編輯器對豬IGF2基因靶點(diǎn)的編輯效率及突變類型。結(jié)果顯示,巴馬豬和大白豬IGF2基因第3內(nèi)含子存在第3 072 bp處的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn),設(shè)計(jì)靶向巴馬豬IGF2基因的單鏈寡核苷酸序列。單鏈寡核苷酸經(jīng)退火后與BsaⅠ線性化的pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒進(jìn)行重組連接,構(gòu)建sgRNA-IGF2表達(dá)質(zhì)粒,重組質(zhì)粒測序結(jié)果表明,sgRNA序列已經(jīng)精確連入U(xiǎn)6啟動(dòng)子和sgRNA骨架之間。將rA1-BE3、hA3A-BE3、hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F 4種胞嘧啶堿基編輯器分別與sgRNA-IGF2表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染... 

【文章來源】：中國畜牧獸醫(yī). 2020,47(11)北大核心

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

sgRNA-IGF2表達(dá)載體測序結(jié)果

本研究共使用rA1-BE3、hA3A-BE3、hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F 4種胞嘧啶堿基編輯器[6](圖1)。在傳統(tǒng)的rA1-BE3中,rA1、Cas9和UGI三者之間通過連接肽進(jìn)行串聯(lián),并利用CMV啟動(dòng)子表達(dá)該融合蛋白。hA3A-BE3使用人源胞嘧啶脫氨酶hA3A替換rA1;hA3A-BE3-Y130F的hA3A中存在第130位的酪氨酸(Tyr)到苯丙氨酸(Phe)的氨基酸突變;hA3A-eBE-Y130F相對于hA3A-BE3-Y130F,利用P2A融合肽,額外表達(dá)3個(gè)游離的UGI。1.1.2 主要試劑

pGL3-U6-sgRNA載體包含U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄表達(dá)的sgRNA骨架,通過將Bsa Ⅰ線性化的pGL3-U6-sgRNA載體與靶向巴馬豬IGF2基因的sgRNA Oligo進(jìn)行重組,對構(gòu)建的sgRNA-IGF2質(zhì)粒進(jìn)行Sanger測序,結(jié)果顯示,sgRNA序列已經(jīng)精確連入U(xiǎn)6啟動(dòng)子和sgRNA骨架之間(圖4)。圖3 IGF2基因位點(diǎn)堿基編輯示意圖

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3330851