本研究根據(jù)非洲豬瘟病毒（ASFV）B646L基因保守序列設(shè)計(jì)nfo RPA特異性引物和探針,建立了ASFV核酸LFD-RPA快速檢測(cè)法。結(jié)果表明,該方法特異性強(qiáng),與豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、口蹄疫病毒（FMDV）、豬A型塞內(nèi)卡病毒（SVA）等病原核酸無交叉反應(yīng);最低可以檢測(cè)到1.57×10²copies/μL重組質(zhì)粒pUC-B646L;檢測(cè)時(shí)間短,其中RPA擴(kuò)增20 min,LFD檢測(cè)10～20 min。應(yīng)用該法及OIE推薦的熒光PCR法對(duì)24個(gè)模擬樣品進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果一致。對(duì)50份已知的臨床樣品核酸進(jìn)行檢測(cè),陽性符合率為73.3%。上述結(jié)果表明,本研究建立的LFD-RPA快速檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便,為ASFV現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供了技術(shù)支持。 

【文章來源】：中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2020,50(08)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

不同引物組合的PCR擴(kuò)增結(jié)果

LFD-RPA特異性檢測(cè)結(jié)果

酸和35份陰性核酸共50份臨床樣品核酸進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證該法與熒光PCR法的符合率。2結(jié)果2.1引物的篩選對(duì)設(shè)計(jì)合成的3條正向引物和3條反向引物采用普通PCR法進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，9種引物組合均出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，其中引物組合F1/R3擴(kuò)增條帶最清晰（圖1），擴(kuò)增片段大小約216bp，與預(yù)期相符，可用于后續(xù)試驗(yàn)。采用的引物及探針序列見表1。2.2LFD-RPA反應(yīng)體系的建立設(shè)定反應(yīng)溫度分別為37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃，LFD-RPA檢測(cè)結(jié)果顯示，上述反應(yīng)溫度條件下均可觀察到陽性檢測(cè)線，其中39℃時(shí)條帶顏色相對(duì)較清晰（圖2），確定最佳反應(yīng)條件為39℃孵育20min。2.3LFD-RPA特異性試驗(yàn)分別以重組質(zhì)粒pUC-B646L以及ASFV、PCV2、CSFV、PRRSV、FMDV、SVA核酸為模板進(jìn)行LFD-RPA檢測(cè)，結(jié)果（圖3）顯示，只有陽性質(zhì)粒pUC-B646L和ASFVDNA檢測(cè)線和控制線均出現(xiàn)條帶，判為陽性；而其他核酸模板及陰性對(duì)照、水對(duì)照僅控制線有條帶，檢測(cè)線無條帶，判為陰性。結(jié)果表明，所建立的方法可以特異性檢測(cè)ASFVDNA，與PCV2、CSFV、PRRSV、FMDV、SVA等病原核酸無交叉反應(yīng)。2.4LFD-RPA靈敏度試驗(yàn)將重組質(zhì)粒pUC-B646L進(jìn)行10倍稀釋，分別以10－3～10－9稀釋度pUC-B646L為模板進(jìn)行LFD-RPA檢測(cè)，結(jié)果顯示，所建立方法可檢測(cè)的最低限為10－7稀釋度，對(duì)應(yīng)濃度為1.57×102copies/L（圖4）；而實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)低限為10－9稀釋度（圖5），比所建立的LFD-RPA法靈敏度高100倍。2.5模擬樣品及臨床樣品的核酸檢測(cè)分別采用LFD-RPA和實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)24份模擬樣品（18份陽性、6份陰性）進(jìn)行檢測(cè)，所建立的LFD-RPA方法檢測(cè)結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光PCR完全一致，可準(zhǔn)確檢測(cè)到其中18份模擬陽性樣品。此外，用所建立方法對(duì)50份已知的臨床樣品核酸進(jìn)行檢測(cè)，?

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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