近年來,隨著人們生活水平的提高,高血脂、動脈粥樣硬化、心肌梗死等心血管疾病已成為危害人類身體健康的頭號殺手。血脂異常,特別是血液中過高的膽固醇含量是引發(fā)這些疾病的主要因素之一。因此,控制高脂血癥的發(fā)生對于預防心腦血管疾病有著重要意義。苜蓿皂苷具有調節(jié)脂質代謝,降低機體膽固醇含量等作用,但是目前對其機理研究并不多,特別是細胞水平上的研究更少。為了研究苜蓿皂苷在細胞水平上對膽固醇代謝的作用,試驗一以大鼠BRL肝細胞為研究對象研究苜蓿皂苷對細胞膽固醇代謝相關基因的影響；試驗二構建膽固醇代謝關鍵基因-低密度脂蛋白受體（LDLR）的串聯(lián)親和純化載體并在293T細胞中表達。具體情況如下：試驗一苜蓿皂苷對大鼠BRL肝細胞基因表達的影響。1、將培養(yǎng)2d的BRL正常細胞隨機分為4組,正常細胞對照A組、正常細胞+苜蓿皂苷50 mg/L B組、正常細胞+苜蓿皂苷100mg/LC組和正常細胞+苜蓿皂苷150mg/LD組。正常BRL細胞分組后培養(yǎng)24 h,加入不同濃度的苜蓿皂苷液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集細胞,運用qRT-PCR檢測細胞內(nèi)LDLR、LXR（肝X受體）和FXR（膽汁酸受體）mRNA的表達。2、采用... 

【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)大學河南省

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
1 文獻綜述
    1.1 苜蓿皂苷降低機體膽固醇的作用及其機理研究進展
        1.1.1 苜蓿皂苷結構
        1.1.2 苜蓿皂苷的理化特征
        1.1.3 苜蓿皂苷的主要生物學活性
            1.1.3.1 苜蓿皂苷具有溶血作用
            1.1.3.2 苜蓿皂苷具有增加免疫、抗氧化作用
            1.1.3.3 苜蓿皂苷具有抗菌消炎作用
            1.1.3.4 苜蓿皂苷具有調節(jié)脂質代謝,降低膽固醇的作用
            1.1.3.5 苜蓿皂苷的其它作用
            1.1.4 苜蓿皂苷降低機體膽固醇的分子機理研究
                1.1.4.1 苜蓿皂苷影響膽固醇的吸收和合成,減少機體膽固醇的來源
                1.1.4.2 苜蓿皂苷加速膽汁酸的排泄,影響肝腸循環(huán)
                1.1.4.3 苜蓿皂苷促進LDL受體、非受體途徑的代謝
                1.1.4.4 苜蓿皂苷影響膽固醇的轉運
    1.2 低密度脂蛋白受體及其調節(jié)機制研究進展
        1.2.1 LDLR的結構和功能
        1.2.2 LDLR的調節(jié)機制
            1.2.2.1 LDLR的膽固醇依賴的調節(jié)機制
            1.2.2.2 LDLR的非膽固醇依賴的調節(jié)機制
        1.2.3 影響LDLR mRNA表達調控的因素
            1.2.3.1 HMG-CoA還原酶抑制劑
            1.2.3.2 激素
            1.2.3.3 膽固醇
            1.2.3.4 植物提取物
            1.2.3.5 其他因素
    1.3 展望
2 引言
3 試驗一 苜蓿皂苷對大鼠BRL肝細胞基因表達的影響
    3.1 材料與方法
        3.1.1 試驗材料
        3.1.2 主要試劑和儀器
        3.1.3 細胞培養(yǎng)前的準備工作
        3.1.4 細胞培養(yǎng)、傳代、凍存和復蘇
            3.1.4.1 細胞培養(yǎng)與傳代
            3.1.4.2 細胞凍存
            3.1.4.3 細胞復蘇
        3.1.5 細胞計數(shù)
        3.1.6 BRL大鼠肝細胞的培養(yǎng)
    3.2 指標測定與方法
        3.2.1 MTT法測定苜蓿皂苷對大鼠BRL肝細胞活性的影響
            3.2.1.1 MTT溶液的配制
            3.2.1.2 細胞活性的測定方法
        3.2.2 mRNA相對表達量測定
            3.2.2.1 大鼠BRL肝細胞總RNA的提取
            3.2.2.2 RNA濃度的測定
            3.2.2.3 總RNA的質量檢測
            3.2.2.4 RNA反轉錄過程
            3.2.2.5 引物設計與合成
            3.2.2.6 熒光定量PCR
            3.2.2.7 統(tǒng)計分析
    3.3 結果與分析
        3.3.1 MTT法檢測苜蓿皂苷對大鼠BRL肝細胞增殖活性的影響
        3.3.2 苜蓿皂苷對正常和脂變大鼠BRL肝細胞LDLR mRNA表達量的影響
        3.3.3 苜蓿皂苷對正常和脂變大鼠BRL肝細胞LXRα mRNA表達量的影響
        3.3.4 苜蓿皂苷對正常和脂變大鼠BRL肝細胞FXR mRNA表達量的影響
    3.4 討論
        3.4.1 MTT法檢測苜蓿皂苷對大鼠BRL肝細胞活性的影響
        3.4.2 苜蓿皂苷對大鼠BRL肝細胞LDLR mRNA表達量的影響
        3.4.3 苜蓿皂苷對大鼠BRL肝細胞LXRα mRNA表達量的影響
        3.4.4 苜蓿皂苷對大鼠BRL肝細胞FXR mRNA表達量的影響
    3.5 小結
4 試驗二 重組質粒pNTAP-LDLR的構建及表達
    4.1 材料與方法
        4.1.1 實驗材料
        4.1.2 主要試劑和儀器
        4.1.3 主要溶液的配制
    4.2 指標測定與方法
        4.2.1 LDLR基因的擴增和T-A克隆
            4.2.1.1 大鼠肝臟總RNA提取
            4.2.1.2 RNA濃度的測定：同試驗一
            4.2.1.3 總RNA的質量檢測：同試驗一
            4.2.1.4 RNA反轉錄過程：同試驗一
            4.2.1.5 引物設計與合成
            4.2.1.6 LDLR片段的擴增和純化回收
            4.2.1.7 LDLR基因T-A克隆
        4.2.2 重組載體的構建和鑒定
            4.2.2.1 重組載體的構建
            4.2.2.2 重組載體的酶切鑒定
        4.2.3 重組質粒轉染HEK-293T檢測目的蛋白表達
            4.2.3.1 293T細胞的培養(yǎng)
            4.2.3.3 Western blotting檢測LDLR蛋白的表達
    4.3 結果
        4.3.1 總RNA提取
        4.3.2 LDLR基因擴增
        4.3.3 PCR產(chǎn)物T-A克隆菌落PCR鑒定及測序鑒定
        4.3.4 pNTAP-LDLR串聯(lián)親和表達載體的構建和酶切鑒定
        4.3.5 pNTAP-LDLR串聯(lián)親和表達載體測序鑒定
        4.3.6 Western blot檢測分析
    4.4 討論
    4.5 小結
5 結論與展望
    5.1 結論
    5.2 展望
參考文獻
英文摘要


【參考文獻】：
期刊論文
[1]苜蓿皂苷對高脂血癥大鼠膽固醇代謝及其相關基因表達的影響[J]. 王先科,史瑩華,王成章,陳明亮,袁德地.  動物營養(yǎng)學報. 2012(05)
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[3]小檗堿對高脂血癥兔脂代謝及肝臟LDLR和SR-B1基因表達的影響[J]. 金磊,何琦,周岐新,楊俊霞.  中國生物制品學雜志. 2010(11)
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[9]肝X受體的研究進展[J]. 王強,江渝.  生理科學進展. 2009(02)
[10]低密度脂蛋白受體及其調節(jié)機制研究進展[J]. 張銳,張紹芬.  國外醫(yī)學(老年醫(yī)學分冊). 2009(01)

博士論文
[1]姜黃素對肝細胞LDLR表達作用的分子機理研究[D]. 竇曉兵.北京中醫(yī)藥大學 2007

碩士論文
[1]用TAP系統(tǒng)篩選與Pygopus-2相互作用蛋白的初步研究[D]. 張毓純.廈門大學 2008
[2]苜蓿皂甙在產(chǎn)蛋雞及蛋雛雞飼糧中的應用研究[D]. 潘俊良.河南農(nóng)業(yè)大學 2007
[3]苜蓿皂甙和草粉對斷奶仔豬和肥育豬生產(chǎn)性能的影響及其機理研究[D]. 王彥華.河南農(nóng)業(yè)大學 2007



本文編號：3326328