副流感病毒5型（PIV5）是一種不分節(jié)段的單股負鏈RNA病毒,屬副黏病毒科、腮腺炎病毒屬。其廣泛存在于自然界,人和多種動物均可感染。據(jù)報道,PIV5在豬群中有較高的感染率,但相關(guān)的病原學(xué)、分子生物學(xué)及遺傳進化分析等研究較少。鑒于此,本研究對本實驗室保存的腹瀉豬小腸組織樣品進行病原分離,并對分離到的PIV5毒株進行F基因、全長基因組遺傳進化分析及致病性研究,旨在為其診斷、防控及后期疫苗研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。利用Vero E6細胞通過盲傳方法進行病毒分離,成功分離出5株副黏病毒。將分離到的病毒置于電鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)副黏病毒樣顆粒。5株毒株均可使雞紅細胞發(fā)生凝集,其血凝性能被雞新城疫標準陽性血清抑制。進一步使用二代測序及RT-PCR方法對其進行鑒定,分析結(jié)果表明這5株毒株均為豬源PIV5毒株,分別被命名為HLJ2015/DP1-1/PIV5、HLJ2015/DP2-1/PIV5、SH/2015/122/PIV5、HuB/YC/2015/PIV5和JX/2015/1221/PIV5。為明確PIV5遺傳變異情況,對5株豬源PIV5毒株F基因進行擴增與測序,對序列進行遺傳進化分析。而后選擇PIV5 SH... 

【文章來源】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)黑龍江省

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

PIV5分離毒株感染VeroE6細胞CPE觀察Fig2-1CytopathogeniceffectsonVeroE6cellsinfectwithPIV5isolationstrain

豬源副流感病毒5型分離、鑒定及其遺傳進化分析182.3.2病毒鑒定結(jié)果2.3.2.1電鏡觀察結(jié)果為對分離病毒進行鑒定，待病毒于細胞內(nèi)增殖至細胞出現(xiàn)CPE后，將培養(yǎng)基與細胞重復(fù)凍融3次，離心留取上清。病毒經(jīng)梯度離心后于透射電鏡下觀察。如圖2-2所示，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)直徑約為100~200nm的病毒粒子。病毒外被囊膜，形態(tài)及大小均與副黏病毒相似。初步證實所分離病毒為PIV5。2.3.2.2血凝及血凝抑制試驗結(jié)果血凝及血凝抑制試驗結(jié)果顯示，5份樣品的病毒液對雞紅細胞具有凝集作用。并且其對雞紅細胞的血凝活性可被雞新城疫陽性標準血清特異性抑制。血凝及血凝抑制結(jié)果如表2-7所示。表2-7血凝及血凝抑制結(jié)果Table2-7Resultsofhemagglutinationandhemagglutinationinhibitiontest2.3.2.3二代測序結(jié)果為進一步對分離毒株進行鑒定，使用Illumina二代測序方法對5株副黏病毒進行序列分析。對測序得到的病毒原始序列進行處理，通過使用NCBIBLASTn和BLASTx非還原蛋白數(shù)據(jù)庫（http://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi）比對。其結(jié)果顯示5株分離株序列與副黏病毒中副流感病毒5型高度一致，證實所分離病毒為PIV5。序列結(jié)果見附錄。毒株名HLJ2015/DP1-1/PIV5HLJ2015/DP2-1/PIV5SH/2015/122/PIV5HuB/YC/2015/PIV5JX/2015/1221/PIV5血凝效價2424252525血凝抑制價2626262525圖2-2PIV5分離毒株病毒粒子電鏡觀察結(jié)果Fig2-2ElectronmicrographofPIV5isolationstrain

PIV5毒株分離及鑒定192.3.3PIV5PCR檢測結(jié)果使用特異性引物對5株P(guān)IV5分離毒株F基因進行擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳鑒定結(jié)果顯示擴增產(chǎn)物為長度1748bp目的片段，5份樣品均擴增出目的條帶，且與預(yù)期大小相符（圖2-3）。2.4討論分離鑒定是病毒生物學(xué)特性研究的基礎(chǔ)，常見的實驗室病毒分離多采用細胞培養(yǎng)傳代的方法，這就要求敏感細胞系的選擇。目前，PIV5廣泛存在于自然界，可于大量細胞系中增殖。但被感染細胞一般不出現(xiàn)CPE，這樣的特性使得PIV5的病毒分離難度增加。1998年，Heinen等于一只流產(chǎn)仔豬肺臟中成功分離一株副流感病毒毒株，將該病毒接種細胞后，鏡下觀察細胞出現(xiàn)顯著CPE，隨后該病毒被證實為PIV5毒株（PIV5SER）[104]。2013年，一株豬源PIV5KNU-11毒株于韓國被分離，Lee等經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)該毒株于豬肺泡巨噬細胞（PAM）內(nèi)培養(yǎng)可使細胞出現(xiàn)CPE。但與SER毒株不同，KNU-11可于細胞內(nèi)引發(fā)更加嚴重和急劇的CPE現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為感染細胞圓聚和皺縮。對兩株毒株的敏感細胞系進行比較發(fā)現(xiàn)，在Vero細胞、牛腎細胞（MDBK）及倉鼠腎傳代細胞（BHK-21）中，SER毒株均可正常進行復(fù)制，KNU-11毒株則不能。SER毒株僅可于個別細胞系中引發(fā)輕微CPE，圖2-3PIV5F基因PCR鑒定結(jié)果Fig2-3TheidentificationforPIV5FgenebyPCRM.DL2000DNAMarker；1.空白對照；2-6.PIV5F基因陽性擴增產(chǎn)物（1748bp）LaneM.DL2000DNAmarker;Lane1.Blankcontrol;Lane2-6.AmplificationproductsofPIV5Fgene(1748bp)2000bp1748bp750bp500bp250bp100bpM1234561000bp

【參考文獻】：
期刊論文
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