過氧化物酶體增殖激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator1alpha, PPARGC1A or PGC-1α）,編碼基因?yàn)镻PARGC1A,作為轉(zhuǎn)錄共激活因子可以與一系列的轉(zhuǎn)錄因子相互作用,參與多種代謝途徑,如適應(yīng)性產(chǎn)熱、線粒體的生物合成、葡萄糖代謝、肝臟糖異生、脂肪酸p氧化、脂肪細(xì)胞分化、肌肉類型轉(zhuǎn)換等。在動物遺傳育種中,由于PPARGC1A參與機(jī)體能量平衡和脂肪代謝調(diào)控的相關(guān)過程,PPARGC1A基因被作為影響動物產(chǎn)乳特性、肉質(zhì)品質(zhì)和動物生長的侯選基因加以研究,目前未發(fā)現(xiàn)該基因在中國地方黃牛品種中的相關(guān)研究。為此本研究利用基因克隆,腺病毒載體構(gòu)建,細(xì)胞培養(yǎng),qPCR,熒光素酶活性測定,DNA池測序,PCR-SSCP及PCR-RFLP等技術(shù)開展了秦川牛PPARGC1A基因的克隆,腺病毒介導(dǎo)的過表達(dá)和干擾技術(shù)對該基因的表達(dá)調(diào)控,及其在調(diào)控線粒體氧化呼吸鏈相關(guān)基因和肌肉細(xì)胞增殖分化相關(guān)基因的功能驗(yàn)證,啟動子區(qū)的克隆及核心啟動區(qū)的篩選分析,基因遺傳變異的掃描及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析等工... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：120 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 PPARGC1A基因研究進(jìn)展
        1.1.1 PPARGC1A基因結(jié)構(gòu)
        1.1.2 PPARGC1A基因的生理功能
        1.1.3 PPARGC1A基因在人類中的多態(tài)性研究
        1.1.4 PPARGC1A基因在畜禽上的研究進(jìn)展
    1.2 腺病毒載體的研究進(jìn)展
        1.2.1 腺病毒生物學(xué)特性
        1.2.2 腺病毒載體的發(fā)展
    1.3 展望
第二章 秦川牛PPARGC1A基因克隆、過表達(dá)腺病毒載體的構(gòu)建及功能驗(yàn)證
    2.1 材料與方法
        2.1.1 試驗(yàn)材料與主要試劑
        2.1.2 引物設(shè)計
        2.1.3 RNA的提取和cDNA的合成
        2.1.4 秦川牛PPARGC1A基因CDS區(qū)克隆
        2.1.5 pGMT-PPARGC1A載體構(gòu)建
        2.1.6 pAdTrack-CMV-PPARGC1A載體的構(gòu)建
        2.1.7 pAdeasy-1-CMV-PPARGC1A載體的構(gòu)建
        2.1.8 腺病毒Ad-PPARGC1A的包裝
        2.1.9 腺病毒Ad-PPARGC1A的收獲及擴(kuò)增
        2.1.10 腺病毒Ad-PPARGC1A滴度的測定
        2.1.11 最佳MOI(Multiplicity of Infection)的確定
        2.1.12 PPARGC1A基因過表達(dá)對牛肌肉細(xì)胞代謝和分化基因表達(dá)的影響
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 RNA提取
        2.2.2 秦川牛PPARGC1A基因CDS區(qū)克隆及pGMT-PPARGC1A載體構(gòu)建
        2.2.3 pAdTrack-CMV-PPARGC1A載體的構(gòu)建
        2.2.4 pAdeasy-1-CMV-PPARGC1A載體的構(gòu)建
        2.2.5 腺病毒Ad-PPARGC1A的包裝
        2.2.6 腺病毒Ad-PPARGC1A的擴(kuò)增及滴度測定
        2.2.7 最佳MOI(Multiplicity Of Infection)的確定
        2.2.8 PPARGC1A基因過表達(dá)后對牛肌肉細(xì)胞代謝和分化相關(guān)基因的影響
    2.3 討論
        2.3.1 腺病毒介導(dǎo)的基因過表達(dá)
        2.3.2 PPARGC1A基因過表達(dá)對牛肌肉細(xì)胞相關(guān)基因的影響
    2.4 小結(jié)
第三章 秦川牛PPARGC1A基因干擾腺病毒載體的構(gòu)建及功能驗(yàn)證
    3.1 材料與方法
        3.1.1 試驗(yàn)材料與主要試劑
        3.1.2 靶向PPARGC1A基因的shRNAs干擾序列的設(shè)計及合成
        3.1.3 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNAs載體的構(gòu)建
        3.1.4 pDsRed1-C1-PPARGC1A表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1.5 有效shRNAs序列的篩選
        3.1.6 pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNAs重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定
        3.1.7 腺病毒的包裝、擴(kuò)增及滴度測定
        3.1.8 最佳MOI(Multiplicity Of Infection)的確定
        3.1.9 PPARGC1A基因沉默后對肌肉細(xì)胞代謝和分化相關(guān)基因表達(dá)的影響
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNAs載體的構(gòu)建
        3.2.2 pDsRed1-C1-PPARGC1A載體的構(gòu)建
        3.2.3 有效shRNAs序列的篩選
        3.2.4 pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNAs重組腺病毒骨架載體的構(gòu)建
        3.2.5 腺病毒的包裝、擴(kuò)增及滴度測定
        3.2.6 最佳MOI(Multiplicity Of Infection)的確定
        3.2.7 PPARGC1A基因沉默后對肌肉細(xì)胞代謝和分化相關(guān)基因表達(dá)的影響
    3.3 討論
        3.3.1 腺病毒載體介導(dǎo)的RNAi
        3.3.2 干擾腺病毒對牛肌肉細(xì)胞代謝和增殖分化相關(guān)基因的影響
    3.4 小結(jié)
第四章 秦川牛PPARGC1A基因啟動子區(qū)的克隆及活性研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 試驗(yàn)材料與主要試劑
        4.1.2 引物設(shè)計與合成
        4.1.3 秦川牛全血DNA的提取
        4.1.4 秦川牛PPARGC1A基因啟動子區(qū)全長擴(kuò)增
        4.1.5 pGMT-Promoter載體的構(gòu)建
        4.1.6 pGL3-Basic-Promoter不同截短載體的構(gòu)建
        4.1.7 pRL-TK和pGL3-Control載體的擴(kuò)增與純化
        4.1.8 HEK293和C2C12細(xì)胞的培養(yǎng)
        4.1.9 pGL3-Basic-Promoter重組系列質(zhì)粒與對照質(zhì)粒pR-TK共轉(zhuǎn)染HEK293和C2C12細(xì)胞
        4.1.10 熒光素酶活性檢測
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 秦川牛PPARGC1A基因啟動子區(qū)全長擴(kuò)增
        4.2.2 pGMT-Promoter載體的構(gòu)建
        4.2.3 pGL3-Basic-Promoter不同截短載體的構(gòu)建
        4.2.4 熒光素酶活性檢測
    4.3 討論
        4.3.1 秦川牛PPARGC1A基因啟動子活性在HEK293及C2C12細(xì)胞系中的差異
        4.3.2 秦川牛PPARGC1A基因啟動子不同截短體的活性差異
    4.4 小結(jié)
第五章 牛PPARGC1A基因遺傳變異及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析
    5.1 材料與方法
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)動物與主要試劑
        5.1.2 血液樣品中基因組DNA提取
        5.1.3 引物設(shè)計及PCR反應(yīng)
        5.1.4 利用DNA池技術(shù)掃描SNPs
        5.1.5 利用PCR-SSCP和PCR-RFLP檢測突變在群體中的分布規(guī)律
        5.1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析模型
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 牛血液樣品中基因組DNA的提取
        5.2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果
        5.2.3 DNA池掃描SNPs
        5.2.4 不同SNPs分型結(jié)果
        5.2.5 PPARGC1A基因多態(tài)位點(diǎn)頻率分布的群體遺傳學(xué)分析
        5.2.6 PPARGC1A基因SNPs與牛生長性狀的關(guān)聯(lián)分析
    5.3 討論
        5.3.1 PPARGC1A基因多態(tài)性在中國地方牛品種與外國牛品種的比較
        5.3.2 牛PPARGC1A基因多態(tài)性與生長性狀之間的關(guān)聯(lián)
    5.4 小結(jié)
第六章 結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn)
    6.1 結(jié)論
    6.2 創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]共激活因子PGC-1α的研究進(jìn)展[J]. 李密杰,張春梅,藍(lán)賢勇,雷初朝,陳宏.  中國牛業(yè)科學(xué). 2012(04)
[2]豬PPARGC1A和CAPNS1基因多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性分析[J]. G.Gandolfi,晉大鵬.  中國畜牧獸醫(yī). 2011(10)
[3]中國荷斯坦奶牛PPARGC1A基因內(nèi)含子9的SNP與產(chǎn)奶性狀的相關(guān)分析[J]. 王杰,原清會,張明,曾長軍,賴松家.  四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報. 2010(02)
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本文編號：3319468