過氧化物酶體增殖激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator1alpha, PPARGC1A or PGC-1α）,編碼基因為PPARGC1A,作為轉錄共激活因子可以與一系列的轉錄因子相互作用,參與多種代謝途徑,如適應性產(chǎn)熱、線粒體的生物合成、葡萄糖代謝、肝臟糖異生、脂肪酸p氧化、脂肪細胞分化、肌肉類型轉換等。在動物遺傳育種中,由于PPARGC1A參與機體能量平衡和脂肪代謝調(diào)控的相關過程,PPARGC1A基因被作為影響動物產(chǎn)乳特性、肉質(zhì)品質(zhì)和動物生長的侯選基因加以研究,目前未發(fā)現(xiàn)該基因在中國地方黃牛品種中的相關研究。為此本研究利用基因克隆,腺病毒載體構建,細胞培養(yǎng),qPCR,熒光素酶活性測定,DNA池測序,PCR-SSCP及PCR-RFLP等技術開展了秦川牛PPARGC1A基因的克隆,腺病毒介導的過表達和干擾技術對該基因的表達調(diào)控,及其在調(diào)控線粒體氧化呼吸鏈相關基因和肌肉細胞增殖分化相關基因的功能驗證,啟動子區(qū)的克隆及核心啟動區(qū)的篩選分析,基因遺傳變異的掃描及其與生長性狀的關聯(lián)分析等工... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：120 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 PPARGC1A基因研究進展
        1.1.1 PPARGC1A基因結構
        1.1.2 PPARGC1A基因的生理功能
        1.1.3 PPARGC1A基因在人類中的多態(tài)性研究
        1.1.4 PPARGC1A基因在畜禽上的研究進展
    1.2 腺病毒載體的研究進展
        1.2.1 腺病毒生物學特性
        1.2.2 腺病毒載體的發(fā)展
    1.3 展望
第二章 秦川牛PPARGC1A基因克隆、過表達腺病毒載體的構建及功能驗證
    2.1 材料與方法
        2.1.1 試驗材料與主要試劑
        2.1.2 引物設計
        2.1.3 RNA的提取和cDNA的合成
        2.1.4 秦川牛PPARGC1A基因CDS區(qū)克隆
        2.1.5 pGMT-PPARGC1A載體構建
        2.1.6 pAdTrack-CMV-PPARGC1A載體的構建
        2.1.7 pAdeasy-1-CMV-PPARGC1A載體的構建
        2.1.8 腺病毒Ad-PPARGC1A的包裝
        2.1.9 腺病毒Ad-PPARGC1A的收獲及擴增
        2.1.10 腺病毒Ad-PPARGC1A滴度的測定
        2.1.11 最佳MOI(Multiplicity of Infection)的確定
        2.1.12 PPARGC1A基因過表達對牛肌肉細胞代謝和分化基因表達的影響
    2.2 結果與分析
        2.2.1 RNA提取
        2.2.2 秦川牛PPARGC1A基因CDS區(qū)克隆及pGMT-PPARGC1A載體構建
        2.2.3 pAdTrack-CMV-PPARGC1A載體的構建
        2.2.4 pAdeasy-1-CMV-PPARGC1A載體的構建
        2.2.5 腺病毒Ad-PPARGC1A的包裝
        2.2.6 腺病毒Ad-PPARGC1A的擴增及滴度測定
        2.2.7 最佳MOI(Multiplicity Of Infection)的確定
        2.2.8 PPARGC1A基因過表達后對牛肌肉細胞代謝和分化相關基因的影響
    2.3 討論
        2.3.1 腺病毒介導的基因過表達
        2.3.2 PPARGC1A基因過表達對牛肌肉細胞相關基因的影響
    2.4 小結
第三章 秦川牛PPARGC1A基因干擾腺病毒載體的構建及功能驗證
    3.1 材料與方法
        3.1.1 試驗材料與主要試劑
        3.1.2 靶向PPARGC1A基因的shRNAs干擾序列的設計及合成
        3.1.3 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNAs載體的構建
        3.1.4 pDsRed1-C1-PPARGC1A表達載體的構建
        3.1.5 有效shRNAs序列的篩選
        3.1.6 pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNAs重組腺病毒載體的構建及鑒定
        3.1.7 腺病毒的包裝、擴增及滴度測定
        3.1.8 最佳MOI(Multiplicity Of Infection)的確定
        3.1.9 PPARGC1A基因沉默后對肌肉細胞代謝和分化相關基因表達的影響
    3.2 結果與分析
        3.2.1 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNAs載體的構建
        3.2.2 pDsRed1-C1-PPARGC1A載體的構建
        3.2.3 有效shRNAs序列的篩選
        3.2.4 pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNAs重組腺病毒骨架載體的構建
        3.2.5 腺病毒的包裝、擴增及滴度測定
        3.2.6 最佳MOI(Multiplicity Of Infection)的確定
        3.2.7 PPARGC1A基因沉默后對肌肉細胞代謝和分化相關基因表達的影響
    3.3 討論
        3.3.1 腺病毒載體介導的RNAi
        3.3.2 干擾腺病毒對牛肌肉細胞代謝和增殖分化相關基因的影響
    3.4 小結
第四章 秦川牛PPARGC1A基因啟動子區(qū)的克隆及活性研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 試驗材料與主要試劑
        4.1.2 引物設計與合成
        4.1.3 秦川牛全血DNA的提取
        4.1.4 秦川牛PPARGC1A基因啟動子區(qū)全長擴增
        4.1.5 pGMT-Promoter載體的構建
        4.1.6 pGL3-Basic-Promoter不同截短載體的構建
        4.1.7 pRL-TK和pGL3-Control載體的擴增與純化
        4.1.8 HEK293和C2C12細胞的培養(yǎng)
        4.1.9 pGL3-Basic-Promoter重組系列質(zhì)粒與對照質(zhì)粒pR-TK共轉染HEK293和C2C12細胞
        4.1.10 熒光素酶活性檢測
    4.2 結果與分析
        4.2.1 秦川牛PPARGC1A基因啟動子區(qū)全長擴增
        4.2.2 pGMT-Promoter載體的構建
        4.2.3 pGL3-Basic-Promoter不同截短載體的構建
        4.2.4 熒光素酶活性檢測
    4.3 討論
        4.3.1 秦川牛PPARGC1A基因啟動子活性在HEK293及C2C12細胞系中的差異
        4.3.2 秦川牛PPARGC1A基因啟動子不同截短體的活性差異
    4.4 小結
第五章 牛PPARGC1A基因遺傳變異及其與生長性狀的關聯(lián)分析
    5.1 材料與方法
        5.1.1 實驗動物與主要試劑
        5.1.2 血液樣品中基因組DNA提取
        5.1.3 引物設計及PCR反應
        5.1.4 利用DNA池技術掃描SNPs
        5.1.5 利用PCR-SSCP和PCR-RFLP檢測突變在群體中的分布規(guī)律
        5.1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析模型
    5.2 結果與分析
        5.2.1 牛血液樣品中基因組DNA的提取
        5.2.2 PCR擴增結果
        5.2.3 DNA池掃描SNPs
        5.2.4 不同SNPs分型結果
        5.2.5 PPARGC1A基因多態(tài)位點頻率分布的群體遺傳學分析
        5.2.6 PPARGC1A基因SNPs與牛生長性狀的關聯(lián)分析
    5.3 討論
        5.3.1 PPARGC1A基因多態(tài)性在中國地方牛品種與外國牛品種的比較
        5.3.2 牛PPARGC1A基因多態(tài)性與生長性狀之間的關聯(lián)
    5.4 小結
第六章 結論與創(chuàng)新點
    6.1 結論
    6.2 創(chuàng)新點
參考文獻
附錄
致謝
作者簡介


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3319468