豬瘟（Classical swine fever,CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一種疾病,它給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。多年來(lái),許多政府和人們針對(duì)豬瘟病毒采取了多種清除措施,然而,這種疾病卻依然頑強(qiáng)的存在并肆虐著。這使得開(kāi)發(fā)出更加有效的抗病策略來(lái)消滅CSFV變得十分必要和緊迫。本研究以豬胎兒成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象,首先對(duì)CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的定點(diǎn)整合技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化和提高。接著,將抗病毒RNA干擾技術(shù)與CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的定點(diǎn)整合技術(shù)相結(jié)合成功的獲得了抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因豬。體內(nèi)及體外的病毒感染結(jié)果證實(shí)該轉(zhuǎn)基因豬對(duì)豬瘟病毒的復(fù)制和增殖具有一定的抑制能力,能顯著減少豬瘟病毒對(duì)豬群的致死率。除此之外,本研究還通過(guò)CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的定點(diǎn)突變技術(shù)探究了LamR基因定點(diǎn)突變對(duì)豬瘟病毒抵抗的影響,發(fā)現(xiàn)豬LamR基因的定點(diǎn)突變能夠是豬的細(xì)胞有效的抵御豬瘟病毒的感染,并成功地獲得了LamR基因精確點(diǎn)突變的基因編輯豬。綜上,本研究證實(shí)了通過(guò)基因工程的手段可以賦予豬體一定的病毒抵御能力,為后續(xù)抗病育種以及抗病毒研究提供... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

CRISPR/Cas9在豬基因組Rosa26基因的靶位示意圖

sgRNA 序列及對(duì)應(yīng) PAM 區(qū)序列如下表：靶基因的序列（5’—3’） PAM 區(qū)序列SgRNA91 GTGAGAGTTATCTGACCGTA AGGSgRNA89 CTTGGGCCTATGCTCAAGAT GGGSgRNA86 ATCTTGACTACCACTGCGAT TGG1.3.2 電轉(zhuǎn)染體系的優(yōu)化通過(guò) BTX 公司的 ECM2001 電轉(zhuǎn)儀對(duì) PFF 細(xì)胞的電轉(zhuǎn)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的目標(biāo)為該電轉(zhuǎn)儀的三個(gè)主要參數(shù)，即：電壓、脈沖長(zhǎng)度、脈沖次數(shù)。通過(guò)將EGFP 表達(dá)質(zhì)粒按照不同的轉(zhuǎn)染參數(shù)的組合進(jìn)行電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，并于轉(zhuǎn)染 48h 后，通過(guò)倒置熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀對(duì) PFFs 的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行評(píng)估。最終，PFFs 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率提高至 96.45%，如圖 1.2

圖 1.3 多種細(xì)胞系的 EGFP 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)熒光圖；Fig1.3 The transfection efficiency of the pEGFP-N1 vector into the indicated cell lineswasanalysed via fluorescence microscopy.最后，本研究還證實(shí)了體外轉(zhuǎn)錄的 mRNA 及 siRNA 也可通過(guò)該電轉(zhuǎn)染體系實(shí)現(xiàn)高效的轉(zhuǎn)染，結(jié)果見(jiàn)圖 1.4。這些結(jié)果暗示了該電轉(zhuǎn)染體系的多能性，為后續(xù)不同細(xì)胞中基因功能的研究提供了保障。


本文編號(hào)：3319401