為進(jìn)一步探究鵝卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)源性脂肪酸合成代謝機(jī)制,利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建靶向鵝硬脂酰輔酶A去飽和酶（stearoyl-coenzyme A desaturase, SCD）基因的慢病毒敲減質(zhì)粒并進(jìn)行慢病毒包裝。首先設(shè)計(jì)鵝SCD基因的單鏈指導(dǎo)RNA（single-guide RNA, sgRNA）序列,其次體外合成并驗(yàn)證裂解效率,最后利用psPAX2和pMD2.G包裝質(zhì)粒制備psgRNA-mCherry-T2A-Puro和pLenti-Cas9-T2A-EGFP慢病毒質(zhì)粒。結(jié)果表明,慢病毒質(zhì)粒被成功構(gòu)建,且其感染中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary, CHO）細(xì)胞后篩選出能同時(shí)表達(dá)紅色熒光蛋白和增強(qiáng)綠色熒光蛋白的強(qiáng)雙陽性細(xì)胞群。這為后續(xù)感染鵝原代顆粒細(xì)胞并敲減其SCD基因研究奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版). 2020,46(05)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

鵝SCD基因sg RNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)示意圖

圖1 鵝SCD基因sg RNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)示意圖2.3 psg RNA-m Cherry-T2A-Puro和p Lenti-Cas9-T2A-EGFP病毒感染CHO細(xì)胞分析

將感染后的CHO細(xì)胞擴(kuò)繁消化，在BD FACSAriaⅡ流式細(xì)胞分析儀上分析細(xì)胞的熒光比例與強(qiáng)度。由圖5可知，psg RNA1-m Cherry-T2A-Puro和p Lenti-Cas9-T2A-EGFP共同感染效率為13.4%,psg RNA3-m Cherry-T2A-Puro和p Lenti-Cas9-T2A-EGFP共同感染效率為11.2%,psg RNANC-m Cherry-T2A-Puro和p Lenti-Cas9-T2A-EGFP共同感染效率為16.6%。利用分選儀器，分別篩選出強(qiáng)雙陽性細(xì)胞群，并接種至24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，篩選后的細(xì)胞能同時(shí)表達(dá)紅色熒光蛋白和增強(qiáng)綠色熒光蛋白（圖6）。3 討論


本文編號(hào)：3318580