圍產(chǎn)期是反芻母畜生產(chǎn)周期中最為關(guān)鍵的時(shí)期。該時(shí)期最大特點(diǎn)是能量負(fù)平衡,此階段母畜的干物質(zhì)采食量和血漿中的非脂化性脂肪酸（NEFA）水平會(huì)發(fā)生巨大的變化。煙酸可以通過(guò)NEFA和p53-SIRT6-Foxo1軸對(duì)肝臟糖異生過(guò)程進(jìn)行調(diào)控,從而促進(jìn)肝臟糖異生緩解能量負(fù)平衡。本研究以體外培養(yǎng)羊肝細(xì)胞為基礎(chǔ),探討NEFA和煙酸對(duì)羊肝細(xì)胞增殖、糖異生限速酶以及p53-SIRT6-Foxo1軸相關(guān)基因的mRNA和蛋白的相關(guān)影響。本試驗(yàn)主要分為以下四個(gè)部分:試驗(yàn)一 利用兩步灌流法對(duì)綿羊肝細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。隨后對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)和功能鑒定,細(xì)胞形態(tài)鑒定用糖原染色法檢測(cè),功能鑒定用細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色法檢測(cè)。形態(tài)鑒定結(jié)果,顯微鏡下染色的細(xì)胞多為圓形或?yàn)槁褕A形,形態(tài)大小不一。貼壁生長(zhǎng)均勻分布,細(xì)胞胞體充盈飽滿,細(xì)胞核分為單核或多核。觀察到的細(xì)胞特征,符合肝細(xì)胞的形態(tài)特征。羊肝細(xì)胞的功能檢測(cè)結(jié)果,肝細(xì)胞中CK18表達(dá)呈陽(yáng)性,即測(cè)定細(xì)胞具有肝細(xì)胞的功能特點(diǎn),測(cè)定細(xì)胞為肝細(xì)胞。此外對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞存活率進(jìn)行了檢測(cè),細(xì)胞周期符合肝細(xì)胞正常的生長(zhǎng)周期,細(xì)胞存活率較高,可滿足試驗(yàn)需求。試驗(yàn)二 肝細(xì)胞中添加NEFA,對(duì)羊... 

【文章來(lái)源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖４本試驗(yàn)技術(shù)路線圖??Ｆｉｇ．４?Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ?ｒｏａｄｍａｐ?ｆｏｒ?ｔｈｉｓ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ??

?內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文???２．１．２試驗(yàn)結(jié)果??２．１．２．１羊肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定結(jié)果??如圖顯微鏡下對(duì)羊肝細(xì)胞進(jìn)行觀察，細(xì)胞多為圓形或?yàn)槁褕A形，形態(tài)大小不??一。貼壁生長(zhǎng)均勻分布，細(xì)胞胞體充盈飽滿，細(xì)胞核分為單核或多核。觀察到的??細(xì)胞特征，符合肝細(xì)胞的形態(tài)特征。目前肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法分為膠原凝膠三明治、??微載體黏附、微囊包裹、球形聚集、中空纖維和單層培養(yǎng)法ｗ］。本試驗(yàn)采用的是??單層培養(yǎng)法。依據(jù)肝臟細(xì)胞的體外培養(yǎng)鑒定技術(shù)，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)鑒定，本試驗(yàn)的??細(xì)胞形態(tài)與參考試驗(yàn)描述一致＾。??Ｉ?■■??。二?＇?：‘ｒ—ｉ?一、？??圖５肝細(xì)胞成像圖??Ｆｉｇ．５?Ｌｉｖｅｒ?ｃｅｌｌ?ｉｍａｇｉｎｇ??角蛋白ＣＫ１８是正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中高特異性表面抗原，可用來(lái)鑒定肝細(xì)胞［Ｂ３］。??羊肝細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行抗ＣＫ１８免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，羊肝細(xì)胞中ＣＫ１８表達(dá)呈??陽(yáng)性。即測(cè)定細(xì)胞具有肝細(xì)胞的功能特點(diǎn)，測(cè)定細(xì)胞為肝細(xì)胞。??圖６免疫熒光檢測(cè)圖片＿??Ｆｉｇ．６?Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｐｉｃｔｕｒｅ??肝細(xì)胞的總產(chǎn)量平均為１．１２ｘｌ〇６／ｇ。存活率達(dá)９０％以上，細(xì)胞培養(yǎng)后占貼??壁率達(dá)９０％以上。本試驗(yàn)的灌流液流速就在原有的基礎(chǔ)上進(jìn)行了調(diào)整，流速放緩??后，收集到的分離細(xì)胞增多。如圖２０為羊肝細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。從圖中可以看出，??第１天細(xì)胞逐漸貼壁，３？４天細(xì)胞開(kāi)始緩慢增殖，４？８天為細(xì)胞的快速増殖時(shí)期，??呈現(xiàn)出對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，隨后進(jìn)入衰退期。羊肝細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線是典型的“Ｓ”型。??

Ｊ２?內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文???４０??３５??細(xì)??胞??密??虔：：??１５??／？！＂??：〇?ｙ??１?２?３?４?５?６?７?Ｅ?９?１Ｃ＇?ＸＩ?１２?１３??細(xì)胞生長(zhǎng)天數(shù)／ｄ??圖７羊肝細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線??Ｆｉｇ．７?Ｇｒｏｗｔｈ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ??２．１．３討論??羊肝細(xì)胞通過(guò)改良的灌流法進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞可持續(xù)培養(yǎng)超過(guò)２周。肝細(xì)胞培??養(yǎng)中，通過(guò)試驗(yàn)總結(jié)不斷的對(duì)灌流法進(jìn)行改良，細(xì)胞的存活率得到了有效提高??％８°］。本試驗(yàn)培養(yǎng)的羊肝細(xì)胞，經(jīng)過(guò)肝細(xì)胞形態(tài)的觀察和功能特征的鑒定，判斷??培養(yǎng)的細(xì)胞為肝細(xì)胞。并且細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線為典型的“Ｓ”型生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞生長(zhǎng)??狀態(tài)良好。試驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行純化可得到純度較高的肝細(xì)胞。??２．２?ＮＥＦＡ對(duì)羊肝細(xì)胞增殖糖異生及ｐ５３－ＳＩＲＴ６－Ｆｏｘｏｌ軸的影響??２．２．１試驗(yàn)方法與材料??２．２．１．１試驗(yàn)設(shè)計(jì)??試驗(yàn)材料為綿羊肝細(xì)胞，采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)處理，將培養(yǎng)９６ｈ處于對(duì)??數(shù)期生長(zhǎng)狀況良好的羊肝細(xì)胞隨機(jī)分組，每組６個(gè)重復(fù)。每處理組的培養(yǎng)基中分??別添加ＮＥＦＡ（０、０．３、０．６、１．２、２．４、４．８）ｍｍｏｌ／Ｌ，處理時(shí)間分別為（０、??０．５、１、２、６、１２、２４、３６）ｈ進(jìn)行細(xì)胞增殖率測(cè)定。依據(jù)增殖率對(duì)細(xì)胞進(jìn)行ＮＥＦＡ??濃度和處理時(shí)間篩選后，測(cè)定選定后條件下細(xì)胞的ＰＣ、ＰＥＰＣＫ活性和相關(guān)基因??的ｍＲＮＡ表達(dá)量。??２．２．１．２測(cè)定方法??試驗(yàn)所需儀器及試劑：紫外分光光度計(jì)、Ｃ０２培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋??（均為Ｔｈｅｒｍｏ公司），ＣＣＫ８試劑盒、ＰＣ、ＰＥＰＣＫ


本文編號(hào)：3318389