在日糧蛋白質的降解過程中，蛋白酶是蛋白質水解為肽或氨基酸的關鍵酶，由于受到純培養(yǎng)技術的影響，瘤胃內分泌蛋白酶的細菌和各種蛋白酶的基因信息知之甚少。本試驗旨在利用蛋白酶選擇性培養(yǎng)基從瘤胃微生物Fosmid文庫中篩選出含蛋白酶活性的克隆子，通過生物信息學分析獲得這些克隆子的基因信息。應用脫脂乳粉和大豆蛋白粉兩種蛋白酶選擇性培養(yǎng)基，從30000個克隆中篩選得到14個具有蛋白酶活性的陽性克隆。利用福林酚試劑法檢測14個蛋白酶克隆子的酶活力，結果表明每個克隆子分別具有不同的蛋白質分解能力。以酪蛋白為底物的克隆子酶活力介于0.59-2.74U/mg之間；以大豆蛋白粉為底物的克隆子酶活力在0.70-7.19U/mg之間。pro10F末端序列與金屬肽酶匹配度為54%，屬于肽酶M13家族，且該克隆蛋白酶最適pH值為7.0。選取兩個克隆利用鳥槍測序法進行測序，經(jīng)GenMark分析，共獲得了53個不同的蛋白序列，其中有兩個屬于不同的肽酶家族的序列片段。為了研究奶牛瘤胃內參與蛋白質降解過程中二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidases Ⅳ，DPP-Ⅳ）的序列特征和酶學性質，從奶牛瘤胃微生物Fosm... 

【文章來源】：中國農業(yè)科學院北京市

【文章頁數(shù)】：121 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

瘤胃氮代謝和微生物合成利用的關系

中國農業(yè)科學院博士學位論文 第二章 瘤胃微生物 Fosmid 文庫蛋白酶陽性克隆的篩選與序列分2.2 結果與分析2.2.1 瘤胃 Fosmid 文庫的復制結果本試驗成功復制了瘤胃微生物 Fosmid 文庫，共 81 個平板（30 000 個克�。�，4 ℃保存，為續(xù)篩選試驗做好準備。2.2.2 蛋白酶陽性克隆的篩選2.2.2.1 脫脂乳粉培養(yǎng)基的篩選通過菌落透明圈的變化，利用脫脂乳粉培養(yǎng)基對瘤胃微生物 Fosmid 文庫的 30 000 個克進行了篩選，初篩得到了 21 個蛋白酶的陽性克隆，圖 2-1 是其中 2 個陽性克隆的篩選結果。對述 21 個陽性克隆利用脫脂乳粉選擇性培養(yǎng)基進行復篩，獲得 3 個能夠穩(wěn)定表達蛋白酶活性的性克隆。

圖 2-3 陽性克隆驗證結果Fig 2-3 Verificative result of protease activity clones注：a 脫脂乳粉培養(yǎng)基篩選結果；b 大豆蛋白粉培養(yǎng)基篩選結果Note: A mean screening result of skim milk medium; B mean screening result of soybean protein medium.2.3 蛋白酶陽性克隆酶活性測定提取 14 個蛋白酶的活性克隆的粗酶液，對 2 種底物利用福林酚試劑方法檢測 14 個活性粗酶活力，活性克隆分別命名為 pro1-pro14。結果表明，以酪蛋白為底物，除 pro7 沒有測酶活性以外，14 個蛋白酶的活性克隆的酶活力中 9 個克隆的酶活力大于 1.95 U/mg，4 個酶活力低于這個值；pro1 酶活力最高為 2.74 U/mg，pro9 酶活力最低，其值為 0.59 U/mg。蛋白粉為底物，7 個克隆的酶活力大于 2.00 U/mg，6 個克隆酶活力小于這個值；pro11 酶高為 7.19 U/mg，pro13 酶活力最低，其值為 0.70 U/mg（圖 2-4）。pro10 和 pro11 分解大豆的活力比其分解酪蛋白的活力高 3 倍多；pro5 和 pro13 分解酪蛋白的活力比其分解大豆蛋能力強。

【參考文獻】：
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本文編號：3311625