在日糧蛋白質(zhì)的降解過程中，蛋白酶是蛋白質(zhì)水解為肽或氨基酸的關(guān)鍵酶，由于受到純培養(yǎng)技術(shù)的影響，瘤胃內(nèi)分泌蛋白酶的細(xì)菌和各種蛋白酶的基因信息知之甚少。本試驗(yàn)旨在利用蛋白酶選擇性培養(yǎng)基從瘤胃微生物Fosmid文庫(kù)中篩選出含蛋白酶活性的克隆子，通過生物信息學(xué)分析獲得這些克隆子的基因信息。應(yīng)用脫脂乳粉和大豆蛋白粉兩種蛋白酶選擇性培養(yǎng)基，從30000個(gè)克隆中篩選得到14個(gè)具有蛋白酶活性的陽性克隆。利用福林酚試劑法檢測(cè)14個(gè)蛋白酶克隆子的酶活力，結(jié)果表明每個(gè)克隆子分別具有不同的蛋白質(zhì)分解能力。以酪蛋白為底物的克隆子酶活力介于0.59-2.74U/mg之間；以大豆蛋白粉為底物的克隆子酶活力在0.70-7.19U/mg之間。pro10F末端序列與金屬肽酶匹配度為54%，屬于肽酶M13家族，且該克隆蛋白酶最適pH值為7.0。選取兩個(gè)克隆利用鳥槍測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)GenMark分析，共獲得了53個(gè)不同的蛋白序列，其中有兩個(gè)屬于不同的肽酶家族的序列片段。為了研究奶牛瘤胃內(nèi)參與蛋白質(zhì)降解過程中二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidases Ⅳ，DPP-Ⅳ）的序列特征和酶學(xué)性質(zhì)，從奶牛瘤胃微生物Fosm... 

【文章來源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：121 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

瘤胃氮代謝和微生物合成利用的關(guān)系

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第二章 瘤胃微生物 Fosmid 文庫(kù)蛋白酶陽性克隆的篩選與序列分2.2 結(jié)果與分析2.2.1 瘤胃 Fosmid 文庫(kù)的復(fù)制結(jié)果本試驗(yàn)成功復(fù)制了瘤胃微生物 Fosmid 文庫(kù)，共 81 個(gè)平板（30 000 個(gè)克�。�，4 ℃保存，為續(xù)篩選試驗(yàn)做好準(zhǔn)備。2.2.2 蛋白酶陽性克隆的篩選2.2.2.1 脫脂乳粉培養(yǎng)基的篩選通過菌落透明圈的變化，利用脫脂乳粉培養(yǎng)基對(duì)瘤胃微生物 Fosmid 文庫(kù)的 30 000 個(gè)克進(jìn)行了篩選，初篩得到了 21 個(gè)蛋白酶的陽性克隆，圖 2-1 是其中 2 個(gè)陽性克隆的篩選結(jié)果。對(duì)述 21 個(gè)陽性克隆利用脫脂乳粉選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，獲得 3 個(gè)能夠穩(wěn)定表達(dá)蛋白酶活性的性克隆。

圖 2-3 陽性克隆驗(yàn)證結(jié)果Fig 2-3 Verificative result of protease activity clones注：a 脫脂乳粉培養(yǎng)基篩選結(jié)果；b 大豆蛋白粉培養(yǎng)基篩選結(jié)果Note: A mean screening result of skim milk medium; B mean screening result of soybean protein medium.2.3 蛋白酶陽性克隆酶活性測(cè)定提取 14 個(gè)蛋白酶的活性克隆的粗酶液，對(duì) 2 種底物利用福林酚試劑方法檢測(cè) 14 個(gè)活性粗酶活力，活性克隆分別命名為 pro1-pro14。結(jié)果表明，以酪蛋白為底物，除 pro7 沒有測(cè)酶活性以外，14 個(gè)蛋白酶的活性克隆的酶活力中 9 個(gè)克隆的酶活力大于 1.95 U/mg，4 個(gè)酶活力低于這個(gè)值；pro1 酶活力最高為 2.74 U/mg，pro9 酶活力最低，其值為 0.59 U/mg。蛋白粉為底物，7 個(gè)克隆的酶活力大于 2.00 U/mg，6 個(gè)克隆酶活力小于這個(gè)值；pro11 酶高為 7.19 U/mg，pro13 酶活力最低，其值為 0.70 U/mg（圖 2-4）。pro10 和 pro11 分解大豆的活力比其分解酪蛋白的活力高 3 倍多；pro5 和 pro13 分解酪蛋白的活力比其分解大豆蛋能力強(qiáng)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Dipeptidyl peptidase-4: A key player in chronic liver disease[J]. Minoru Itou,Takumi Kawaguchi,Eitaro Taniguchi,Michio Sata.  World Journal of Gastroenterology. 2013(15)
[2]云南藥用野生稻BIBAC文庫(kù)混合克隆池制備及篩選[J]. 劉艷平,程在全,殷富有,余騰瓊,張敦宇,郭怡卿,張薇,黃興奇.  生物技術(shù)通報(bào). 2012(02)
[3]宏基因組學(xué)及其在瘤胃微生物中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 吳錫川,楊舒黎,茍瀟,冷靜,毛華明.  中國(guó)畜牧獸醫(yī). 2011(12)
[4]奶牛瘤胃微生物BAC文庫(kù)中ACCase基因的篩選與生物信息學(xué)分析[J]. 趙圣國(guó),王加啟,卜登攀,劉開朗,朱雅新,周凌云.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2011(05)
[5]尼羅羅非魚微陣列Fosmid基因組文庫(kù)的構(gòu)建及基因篩選[J]. 李明輝,吳風(fēng)瑞,熊傳奇,曾圣,楊世杰,葉凱,蔣汶洮,孫運(yùn)侶,黃寶鋒,魏瑩瑩,焦靜,顧源,王德壽.  水產(chǎn)學(xué)報(bào). 2011(01)
[6]溫室黃瓜根結(jié)線蟲發(fā)生地土壤微生物宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建及其一個(gè)殺線蟲蛋白酶基因的篩選[J]. 趙志祥,蘆小飛,陳國(guó)華,楊宇紅,茆振川,劉二明,謝丙炎.  微生物學(xué)報(bào). 2010(08)
[7]一個(gè)新型湖羊瘤胃木聚糖酶基因的克隆和鑒定[J]. 馮國(guó)棟,許艷艷,呂丹青,陳振明,張朝暉,周曉云.  科技通報(bào). 2010(03)
[8]湖羊瘤胃微生物Fosmid文庫(kù)的構(gòu)建和分析[J]. 王佳堃,安培培,陳振明,葉均安,劉建新.  動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào). 2010(02)
[9]宏基因組學(xué)方法分析奶牛瘤胃尿素分解菌的多樣性[J]. 趙圣國(guó),王加啟,劉開朗,李旦,于萍.  中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2010(01)
[10]荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因組Fosmid文庫(kù)的構(gòu)建與分析[J]. 李旦,王加啟,卜登攀,劉開朗,李發(fā)弟.  微生物學(xué)雜志. 2009(06)



本文編號(hào)：3311625