白細(xì)胞介素-10（Interleukin10，IL-10）是一種由多種細(xì)胞產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，主要生物學(xué)功能是限制和終止炎癥反應(yīng)，調(diào)控一些免疫細(xì)胞的分化和增殖。雞白細(xì)胞介素10（ChIL-10）基因編碼175個氨基酸，與人和小鼠IL-10的核苷酸同源性分別為45%和42%，有與哺乳動物IL-10蛋白相似的生物學(xué)功能。本研究以不同濃度的脂多糖（LPS）和刀豆素A（ConA）分別刺激體外分離培養(yǎng)的雞脾臟和外周血淋巴細(xì)胞（PBL），提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增成熟ChIL-10蛋白的編碼產(chǎn)物，并以pET-30a（+）為原核表達(dá)載體成功構(gòu)建原核重組質(zhì)粒pET-ChIL-10，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后獲得大小約為26kDa以包涵體形式存在的ChIL-10重組蛋白。切取經(jīng)SDS-PAGE后重組蛋白所在凝膠，研磨后免疫新西蘭大白兔和BALB/c小鼠，制備了兔抗ChIL-10血清和鼠抗ChIL-10血清。設(shè)計兩對真核表達(dá)系統(tǒng)引物，分別擴(kuò)增ChIL-10全長編碼區(qū)（CDS）基因（ChIL-10F）和成熟蛋白CDS區(qū)基因（ChIL-10M）（去信號肽），以含有嘌呤... 

【文章來源】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

ChIL-10基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

的鑒定重組質(zhì)粒，EcoR Ⅰ和X473 bp，與pET-30a載體IL-10中目的基因的核苷0 的雙酶切產(chǎn)物；M：D EcoR Ⅰ /Xho Ⅰ; M: DL組質(zhì)粒 pMD-ChIL-10 的gestion analysis of the rec1 M20000400700bp

3.1.2.2 重組質(zhì)粒 pET-ChIL-10 的鑒定提取與pET-30a載體連接后的重組質(zhì)粒，EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果表明，所得兩條片段大小分別為5400 bp和473 bp，與pET-30a載體和ChIL-10的大小相符，如圖3-3。且測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pET-ChIL-10中目的基因的核苷酸序列與參考序列完全一致。3.1.3 ChIL-10 重組蛋白的 SDS-PAGE 分析3.1.3.1 pET-ChIL-10 重組菌的誘導(dǎo)pET-ChIL-10 的 SDS-PAGE 電泳結(jié)果表明，pET-ChIL-10 重組菌在分子量約 26 kDa 處有一條明顯的特異性蛋白條帶，與 ChIL-10 重組蛋白預(yù)期分子量大小一致，未誘導(dǎo)菌在相同位1：pMD-ChIL-10 的雙酶切產(chǎn)物；M：DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1: pMD-ChIL-10 by EcoR Ⅰ /Xho Ⅰ; M: DL 10 000 DNA Marker圖 3-2 重組質(zhì)粒 pMD-ChIL-10 的雙酶切鑒定Fig. 3-2 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid pMD-ChIL-1020005004000100047327001 M250bp1：pET-ChIL-10 的雙酶切產(chǎn)物；M：DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1: pET-ChIL-10by EcoR Ι/Xho Ι; M: DL2 000 DNA Marker圖 3-3 重組質(zhì)粒 pET-ChIL-10 的雙酶切鑒定Fig. 3-3 Re


本文編號：3307001