干擾素刺激基因15（ISG15）是一種類泛素蛋白,可在干擾素刺激下由isg15基因編碼產(chǎn)生。其在序列、結(jié)構(gòu)和功能上均與泛素類似,能夠通過(guò)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)共價(jià)修飾靶蛋白。ISG15及其類泛素修飾系統(tǒng)參與免疫應(yīng)答,是干擾素發(fā)揮抗病毒效應(yīng)的重要途徑。本研究利用重組豬IFN-α作為標(biāo)準(zhǔn)刺激物,驗(yàn)證了檢測(cè)ISG15及ISG化方法的可行性,包括采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RQ-RT-PCR）檢測(cè)ISG15轉(zhuǎn)錄水平;采用間接免疫熒光（IFA）、流式細(xì)胞術(shù)（FCM）和免疫印跡（WB）三種技術(shù)檢測(cè)ISG15翻譯水平;采用WB檢測(cè)ISG15修飾水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這些方法均能有效地檢測(cè)ISG15及ISG化。通過(guò)上述方法的聯(lián)合應(yīng)用,本研究證實(shí)了豬瘟病毒感染可引起ISG15轉(zhuǎn)錄、翻譯和修飾水平發(fā)生顯著上調(diào)。以1moi豬瘟病毒感染PK-15細(xì)胞為例,使用RQ-RT-PCR可在病毒感染9、12、24和48 h后發(fā)現(xiàn)ISG15 mRNA分別上調(diào)15.89、65.80、121.94和128.89倍;使用IFA可在病毒感染9 h后觀察到ISG15顯著上調(diào);使用FCM可在病毒感染6、12、24 h后發(fā)現(xiàn)ISG15陽(yáng)性細(xì)胞率由0 h... 

【文章來(lái)源】：廣西大學(xué)廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：82 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１?ＩＳＧ１５初級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖??Ｆｉｇ．１－１?Ｔｈｅ?ｐｒｉｍａｒｙ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＩＳＧ１５??

ＩＦＮ－（３等保護(hù)性細(xì)胞因子表達(dá)。誘生的Ｉ型干擾素釋放后，可與細(xì)胞膜表面的特異性受??體結(jié)合，活化ＭＫ／ＳＴＡＴ信號(hào)通路，表達(dá)包括ＩＳＧ１５在內(nèi)的多種抗病毒蛋白，從而發(fā)揮??固有免疫的抗病毒效應(yīng)（如圖１－３所示）。??Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｒｔｘ??ＴＬＲ４?ｏｒ?Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ??＼?／?＾ｖＳ，ｎ？ｎ，?／?，一ｉｒｆ，??＼?（?＼?，ＫＫｙ?？現(xiàn)（??＾?／?／?二—ＩＫＫ－．?ｙ?＜－ＳＴＡＴ＾＞??ＩＫＫ－ｔ／．?Ｊ?ｙ??Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ?ｊ?Ｖｎｆ－ｋＵ?衊?ｋ￣?）ＰＫＲ?＾??贏?ｃ－Ｊａｎ＞ＡＴＦ?２??ＩＫＫ３／３／７＾?????．．＊：：：：：：：：?＊＼Ｌ?＊３＾３?ＩＫ、火?ＪＦ?ＩＳＧＩ５．＜－／Ｖ／＊，；；：？＊：：；：．．＾??：？？？？？？？？？？？?＾?？?Ｉ￣?Ｉ￣＂??ＩＲＦ?ｓｉｔｅ?＼Ｐ?Ｉ?ｓｉｔｅ?ｋＩＩ?ｓｉｔｅ?ＩＳＫＥ??圖１－３?ＩＳＧ１５表達(dá)調(diào)控示意圖??Ｆｉｇ．?１－３?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＩＳＧ１５??（引自?ＬｉｕＸ?等［－１８］，ＤｏｙｌｅＳ［３９］）??當(dāng)病毒侵襲細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞可通過(guò)Ｔｏｌｌ樣受體（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ?ｒｅｃｅｐｔｏｒ，?ＴＬＲ）、視黃酸（維??甲酸）誘導(dǎo)基因蛋白１樣受體（ＲＩＧ－Ｉ－ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＲＬＲ）、黑色素瘤分化相關(guān)基因５??（Ｍｅｌａｎｏｍａ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?ｐｒｏｔｅｉｎ?５，?ＭＤＡ－５?）和雙鏈?ＲＮＡ?依

１．３．３?ＩＳＧ１５的類泛素膽系統(tǒng)??ＩＳＧ１５類泛素修飾系統(tǒng)與泛素－蛋白酶體系統(tǒng)類似，同樣是一系列酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可分??為兩個(gè)階段（如圖１－４所示）。其中，ＩＳＧ１５通過(guò)雙甘氨酸序列與靶蛋白結(jié)合，并進(jìn)行共??價(jià)修飾的過(guò)程被稱為ＩＳＧ化（ＩＳＧｙｌａｔｉｏｎ）：將ＩＳＧ１５從靶蛋白上移除的過(guò)程被稱為去ＩＳＧ??化（ｄｅｌＳＧｙｌａｔｉｏｎ）。??［＂?Ｍ?ｙ－ＳＨ??ＶＢＰ４３（ＶＳＰ１Ｈ），?Ｗ?＜ｊｓｇＴＴ＞??Ｌ�。樱校玻兀剩樱校担蹋樱校保�，?＾??ＬＳＰ１４９ｅｔａＬ?、?〇??（〇?（??響?ｆ?１?ＶＢＣＨ６，?Ｉ?ＢＣＨ８??（Ｉ＇ｒ．ｎ．ｉｉＭ?ＥＶ?Ｆ．ＦＰ（ＴＲ１Ｍ２Ｓ），?ＨＥＲＣＳ（ＣＥＲｌ）??圖１－４?ＩＳＧ?１５類泛素修飾系統(tǒng)示意圖??Ｆｉｇ．?１－４?Ｔｈｅ?ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅ?ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｓｙｓｔｅｍ?ｏｆ?ＩＳＧ?１５??（引自?Ｐｉｔｈａ－Ｒｏｗｅ?Ｉ?Ｆ?等【３３】，Ｊｅｏｎ?Ｙ?Ｊ?等［５２】）??參與ＩＳＧ化過(guò)程的酶類包括類泛素Ｅｌ激活酶、類泛素Ｅ２結(jié)合酶和類泛素Ｅ３連接??酶，而進(jìn)行去ＩＳＧ化則為一系列解聚酶［５３］。經(jīng)研究鑒定，ＵＢＥ１Ｌ是類泛素Ｅ１激活酶，??ＵＢＣＨ６?和?ＵＢＣＨ８?是類泛素?Ｅ２?結(jié)合酶［３３］，ＥＰＦ［５４】、ＨＥＲＣ５［２４］＾ａＴＲＩＭ２５?是類泛素?Ｅ３??連接酶


本文編號(hào)：3306910