干擾素刺激基因15（ISG15）是一種類泛素蛋白,可在干擾素刺激下由isg15基因編碼產(chǎn)生。其在序列、結構和功能上均與泛素類似,能夠通過酶級聯(lián)反應共價修飾靶蛋白。ISG15及其類泛素修飾系統(tǒng)參與免疫應答,是干擾素發(fā)揮抗病毒效應的重要途徑。本研究利用重組豬IFN-α作為標準刺激物,驗證了檢測ISG15及ISG化方法的可行性,包括采用實時定量逆轉錄PCR（RQ-RT-PCR）檢測ISG15轉錄水平;采用間接免疫熒光（IFA）、流式細胞術（FCM）和免疫印跡（WB）三種技術檢測ISG15翻譯水平;采用WB檢測ISG15修飾水平。實驗結果表明這些方法均能有效地檢測ISG15及ISG化。通過上述方法的聯(lián)合應用,本研究證實了豬瘟病毒感染可引起ISG15轉錄、翻譯和修飾水平發(fā)生顯著上調(diào)。以1moi豬瘟病毒感染PK-15細胞為例,使用RQ-RT-PCR可在病毒感染9、12、24和48 h后發(fā)現(xiàn)ISG15 mRNA分別上調(diào)15.89、65.80、121.94和128.89倍;使用IFA可在病毒感染9 h后觀察到ISG15顯著上調(diào);使用FCM可在病毒感染6、12、24 h后發(fā)現(xiàn)ISG15陽性細胞率由0 h... 

【文章來源】：廣西大學廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１?ＩＳＧ１５初級結構示意圖??Ｆｉｇ．１－１?Ｔｈｅ?ｐｒｉｍａｒｙ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＩＳＧ１５??

ＩＦＮ－（３等保護性細胞因子表達。誘生的Ｉ型干擾素釋放后，可與細胞膜表面的特異性受??體結合，活化ＭＫ／ＳＴＡＴ信號通路，表達包括ＩＳＧ１５在內(nèi)的多種抗病毒蛋白，從而發(fā)揮??固有免疫的抗病毒效應（如圖１－３所示）。??Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｒｔｘ??ＴＬＲ４?ｏｒ?Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ??＼?／?＾ｖＳ，ｎ？ｎ，?／?，一ｉｒｆ，??＼?（?＼?，ＫＫｙ?？現(xiàn)（??＾?／?／?二—ＩＫＫ－．?ｙ?＜－ＳＴＡＴ＾＞??ＩＫＫ－ｔ／．?Ｊ?ｙ??Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ?ｊ?Ｖｎｆ－ｋＵ?衊?ｋ￣?）ＰＫＲ?＾??贏?ｃ－Ｊａｎ＞ＡＴＦ?２??ＩＫＫ３／３／７＾?????．．＊：：：：：：：：?＊＼Ｌ?＊３＾３?ＩＫ、火?ＪＦ?ＩＳＧＩ５．＜－／Ｖ／＊，；；：？＊：：；：．．＾??：？？？？？？？？？？？?＾?？?Ｉ￣?Ｉ￣＂??ＩＲＦ?ｓｉｔｅ?＼Ｐ?Ｉ?ｓｉｔｅ?ｋＩＩ?ｓｉｔｅ?ＩＳＫＥ??圖１－３?ＩＳＧ１５表達調(diào)控示意圖??Ｆｉｇ．?１－３?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＩＳＧ１５??（引自?ＬｉｕＸ?等［－１８］，ＤｏｙｌｅＳ［３９］）??當病毒侵襲細胞時，細胞可通過Ｔｏｌｌ樣受體（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ?ｒｅｃｅｐｔｏｒ，?ＴＬＲ）、視黃酸（維??甲酸）誘導基因蛋白１樣受體（ＲＩＧ－Ｉ－ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＲＬＲ）、黑色素瘤分化相關基因５??（Ｍｅｌａｎｏｍａ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?ｐｒｏｔｅｉｎ?５，?ＭＤＡ－５?）和雙鏈?ＲＮＡ?依

１．３．３?ＩＳＧ１５的類泛素膽系統(tǒng)??ＩＳＧ１５類泛素修飾系統(tǒng)與泛素－蛋白酶體系統(tǒng)類似，同樣是一系列酶級聯(lián)反應，可分??為兩個階段（如圖１－４所示）。其中，ＩＳＧ１５通過雙甘氨酸序列與靶蛋白結合，并進行共??價修飾的過程被稱為ＩＳＧ化（ＩＳＧｙｌａｔｉｏｎ）：將ＩＳＧ１５從靶蛋白上移除的過程被稱為去ＩＳＧ??化（ｄｅｌＳＧｙｌａｔｉｏｎ）。??［＂?Ｍ?ｙ－ＳＨ??ＶＢＰ４３（ＶＳＰ１Ｈ），?Ｗ?＜ｊｓｇＴＴ＞??Ｌ�。樱校玻兀剩樱校�，ＬＳＰ１３，?＾??ＬＳＰ１４９ｅｔａＬ?、?〇??（〇?（??響?ｆ?１?ＶＢＣＨ６，?Ｉ?ＢＣＨ８??（Ｉ＇ｒ．ｎ．ｉｉＭ?ＥＶ?Ｆ．ＦＰ（ＴＲ１Ｍ２Ｓ），?ＨＥＲＣＳ（ＣＥＲｌ）??圖１－４?ＩＳＧ?１５類泛素修飾系統(tǒng)示意圖??Ｆｉｇ．?１－４?Ｔｈｅ?ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅ?ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｓｙｓｔｅｍ?ｏｆ?ＩＳＧ?１５??（引自?Ｐｉｔｈａ－Ｒｏｗｅ?Ｉ?Ｆ?等【３３】，Ｊｅｏｎ?Ｙ?Ｊ?等［５２】）??參與ＩＳＧ化過程的酶類包括類泛素Ｅｌ激活酶、類泛素Ｅ２結合酶和類泛素Ｅ３連接??酶，而進行去ＩＳＧ化則為一系列解聚酶［５３］。經(jīng)研究鑒定，ＵＢＥ１Ｌ是類泛素Ｅ１激活酶，??ＵＢＣＨ６?和?ＵＢＣＨ８?是類泛素?Ｅ２?結合酶［３３］，ＥＰＦ［５４】、ＨＥＲＣ５［２４］＾ａＴＲＩＭ２５?是類泛素?Ｅ３??連接酶


本文編號：3306910