流行性乙型腦炎（Japanese encephalitis，JE）是亞洲地區(qū)最為嚴(yán)重的流行性腦炎，是一種人獸共患性急性傳染病。該病嚴(yán)重威脅人類健康，同時(shí)對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大危害。該病目前沒有特異治療方法，疫苗免疫是預(yù)防控制該病的有效措施。傳統(tǒng)滅活疫苗和弱毒疫苗具有良好的免疫原性，在預(yù)防和控制乙型腦炎的歷史中發(fā)揮了重要作用。但是基于JEV全病毒制造的滅活疫苗成本高且有副作用，減毒活疫苗免疫原性好但也存在潛在的安全問題。因此人們將目光投向了尋求更安全有效的新型疫苗研究開發(fā)中。研究表明，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的JEV M和E蛋白能夠組裝成病毒樣顆粒（VLP），其在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和免疫保護(hù)力上同JEV病毒粒子有著相似的能力，而且病毒樣顆粒不含病毒核酸物質(zhì)，有極高的安全性。通過構(gòu)建真核表達(dá)細(xì)胞系產(chǎn)生VLP，是制備JE理想候選疫苗的策略之一。但黃病毒膜蛋白對(duì)表達(dá)細(xì)胞有毒性作用，使建立穩(wěn)定表達(dá)VLP的細(xì)胞系存在障礙。研究表明這種毒性作用是由E蛋白與細(xì)胞膜的融合作用引起的，而prM蛋白的剪切影響著JEV病毒粒子的成熟以及病毒粒子與細(xì)胞的結(jié)合與融合。本研究試圖通過改變prM的剪切位點(diǎn)來抑制表達(dá)JEV VLP... 

【文章來源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：47 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

prM蛋白剪切位點(diǎn)氨基酸突變及引物示意圖

320 倍稀釋； JEV病毒液室溫下融化，5 000 rpm 離心 5 min，將病毒上清稀釋成釋的血清與病毒液混合按體積比1:1 充分混合搖勻，置與 37 ℃溫畢后，迅速將病毒一血清混合物以及對(duì)照組的血清接種于 24 孔L； 5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 6 h 后每孔加入 600 μL 含 3%羧甲基纖3 天后倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 洗滌后加入含 0.1%結(jié)晶紫的甲醛固果增電泳對(duì) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)改進(jìn)反應(yīng)條件后，一致，pr 片段的大小為 350 bp 和突變后的 M-E 片段大小為 170pr M12 3 45

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建2.3.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定將 pr 基因片段分別與五種不同的 M-E 基因片段連接到長(zhǎng)度約 7 000 bp 的真核表達(dá)載體pCAG-neo 中，該載體上含有在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所需要的操控元件和用于篩選的抗性基因，重組質(zhì)粒經(jīng) Sca I 單酶切得到 9 000 bp 的片段，經(jīng) Sac I 與 Xho I 雙酶切鑒定得到 7 000 bp 和 2 100 bp的 DNA 片段，與預(yù)期相符合（圖 2-2）。進(jìn)一步測(cè)序證實(shí)擴(kuò)增所得目的片段的核酸序列符合設(shè)計(jì)要求的突變結(jié)果。prM(ΔR89)EprM(ΔR91)E prM(R89A)EprM(R91A)E prM(R92A)E

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]穩(wěn)定表達(dá)乙型腦炎病毒NS1蛋白細(xì)胞系的建立[J]. 陳振師,劉立科,汪恩強(qiáng),李業(yè)南,華榮虹.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2011(12)
[2]流行性乙型腦炎病毒E蛋白單克隆抗體的制備與鑒定[J]. 趙付榮,華榮虹,王斌,陳娜莎,阿合買提·買買提,步志高.  中國(guó)獸醫(yī)雜志. 2010(01)



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