豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRS virus,PRRSV）引起,在全球養(yǎng)豬生產(chǎn)中最重要的烈性傳染病之一。該病的主要特征是生產(chǎn)母豬的繁殖障礙表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎,以及仔豬呼吸系統(tǒng)疾病。因PRRSV的抗原具有高突變性、以及病毒的持續(xù)感染等特征,至今仍沒(méi)有開(kāi)發(fā)出完全有效的商業(yè)疫苗,難以對(duì)該病進(jìn)行有效的預(yù)防和治療。因此,宿主本身對(duì)抗PRRSV的研究變得至關(guān)重要,既能深入剖析PRRSV感染后的致病機(jī)制,又為進(jìn)一步的疫苗開(kāi)發(fā)提供理論指導(dǎo)。microRNAs（miRNAs）是一類可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的非編碼小RNA,目前大量的研究表明,miRNAs能夠靶向病毒基因組或宿主基因來(lái)影響病毒的復(fù)制。我們前期的研究結(jié)果表明,豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）的宿主源microRNA miR-10a能夠顯著抑制PRRSV在PAMs中的復(fù)制,并證明了miR-10a是通過(guò)特異性抑制其下游靶基因SRP14的翻譯來(lái)抑制PRRSV復(fù)制的。但miR-10a的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制仍不清楚,為了闡明這一... 

【文章來(lái)源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：63 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要符號(hào)對(duì)照表
第一章 豬繁殖與呼吸綜合征病毒與miR-10a的研究進(jìn)展
    1.1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒研究進(jìn)展
        1.1.1 PRRSV的病毒學(xué)特征
        1.1.2 PRRSV的致病機(jī)理
        1.1.3 PRRSV的防控現(xiàn)狀
    1.2 .microRNAs的研究進(jìn)展
        1.2.1 microRNAs的發(fā)現(xiàn)及加工合成機(jī)制
        1.2.2 microRNA的作用機(jī)制
        1.2.3 microRNA靶基因的預(yù)測(cè)及鑒定
        1.2.4 microRNAs在病毒感染中的作用
        1.2.5 microRNAs對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)控
        1.2.6 microRNAs在PRRSV感染中的研究
        1.2.7 miR-10a的研究進(jìn)展
第二章 豬源miR-10a啟動(dòng)子區(qū)的克隆及其核心啟動(dòng)子區(qū)的鑒定
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 細(xì)胞和載體
        2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及耗材
        2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 豬源miR-10a啟動(dòng)子區(qū)的預(yù)測(cè)及引物設(shè)計(jì)
        2.2.2 豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)的分離凍存及基因組的提取
        2.2.3 構(gòu)建豬源miR-10a啟動(dòng)子區(qū)的雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒
        2.2.4 雙熒光素酶活性報(bào)告檢測(cè)啟動(dòng)子區(qū)的活性
        2.2.5 豬源miR-10a啟動(dòng)子區(qū)第一次梯度截短報(bào)告載體的構(gòu)建
        2.2.6 miR-10a啟動(dòng)子區(qū)第一次梯度截短報(bào)告載體的熒光素酶活性檢測(cè)
        2.2.7 豬源miR-10a啟動(dòng)子區(qū)第二次梯度截短報(bào)告載體的構(gòu)建
        2.2.8 miR-10a啟動(dòng)子區(qū)第二次梯度截短報(bào)告載體的熒光素酶活性檢測(cè)
        2.2.9 豬源miR-10a啟動(dòng)子區(qū)第三次梯度截短報(bào)告載體的構(gòu)建
        2.2.10 miR-10a啟動(dòng)子區(qū)第三次梯度截短報(bào)告載體的熒光素酶活性檢測(cè)
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 豬源miR-10a啟動(dòng)子區(qū)的預(yù)測(cè)
        2.3.2 豬源miR-10a啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.3 豬源miR-10a啟動(dòng)子區(qū)熒光素酶活性檢測(cè)
        2.3.4 豬源miR-10a啟動(dòng)子區(qū)第一次梯度截短熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果
        2.3.5 豬源miR-10a啟動(dòng)子區(qū)第二次梯度截短熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果
        2.3.6 豬源miR-10a啟動(dòng)子區(qū)第三次梯度截短熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 豬源miR-10轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)分析及鑒定
    3.1 試驗(yàn)材料
        3.1.1 細(xì)胞、病毒和載體
        3.1.2 主要試驗(yàn)試劑和耗材
        3.1.3 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備
        3.1.4 qRT-PCR檢測(cè)引物
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)
        3.2.2 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變熒光素酶報(bào)告重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.3 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性檢測(cè)
        3.2.4 PAMs細(xì)胞的復(fù)蘇及鋪板
        3.2.5 BAY11-7082預(yù)處理PAMs細(xì)胞
        3.2.6 PAMs細(xì)胞接毒
        3.2.7 細(xì)胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
        3.2.8 熒光定量PCR
        3.2.9 上清樣品中病毒的滴度測(cè)定
        3.2.10 Western blot檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)
        3.2.11 慢病毒介導(dǎo)的過(guò)表達(dá)SRP14細(xì)胞株的構(gòu)建
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析
        3.3.2 突變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)后熒光素酶活性檢測(cè)
        3.3.3 NF-κB與負(fù)調(diào)控miR-10a對(duì)PRRSV的抑制作用
        3.3.4 SRP14促進(jìn)PRRSV的復(fù)制
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]miRNAs as new molecular insights into inflammatory bowel disease: Crucial regulators in autoimmunity and inflammation[J]. Xiao-Min Xu,Hong-Jie Zhang.  World Journal of Gastroenterology. 2016(07)
[2]應(yīng)用雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)斑馬魚(yú)microRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)[J]. 楊紅波,梁巍,劉新星,朱作言,林碩,張博.  遺傳. 2012(09)



本文編號(hào)：3304025