用交叉引物恒溫擴增技術（Cross priming amplification,CPA）和核酸試紙條檢測方法（Nucleic acid test strip detection methord）快速檢測霍亂弧菌。根據(jù)霍亂弧菌的MDH基因序列設計特異性的引物和探針,通過對反應體系與反應條件進行優(yōu)化,確立最佳反應體系,并將CPA方法與PCR法進行比較與評價。對霍亂弧菌的檢測具有高度特異性,對霍亂弧菌的檢出極限達到了6×102CFU/mL,高于PCR,而且具有較好的穩(wěn)定性。交叉引物恒溫擴增技術（Cross priming amplification,CPA）-核酸試紙條檢測方法（Nucleic acid test strip detection methord）是一種特異、靈敏、快速、簡便的霍亂弧菌的檢測方法。 

【文章來源】：生物技術通報. 2013,(07)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

可行性驗證試紙條結果圖

lyticus（ATCC17802）-Vibrioparahaemolyticus（ATCC27519）-Vibrioalginolyticus（ATCC33787）-Vibrioalginolyticus（ATCC17749）-Escherichiacoli（ATCC25922）-Staphylococcusaureus（ATCC25923）-2.4靈敏度試驗結果用霍亂弧菌CPA-核酸試紙條快速檢測方法的最佳反應體系擴增不同稀釋度的霍亂弧菌（ATCC14035）（6×105CFU/mL），從試紙條結果看，隨著模板濃度的降低，至稀釋度為10-4時，沒有出現(xiàn)檢測線，說明此方法的檢測靈敏度為起始菌液濃度的10-3即6×102CFU/mL。從電泳結果（圖3）可以看出，隨著模板濃度的降低，至稀釋度為10-4時沒有擴增產(chǎn)物，與試紙條的結果一致。1：10-1；2：10-2；3：10-3；4：10-4；5：陰性對照；M：marker圖3靈敏度試驗試紙條結果（A）以及靈敏度試驗電泳結果（B）2.5普通PCR方法與CPA方法的比較結果用普通PCR方法擴增不同稀釋度的霍亂弧菌（ATCC14035）（6×105CFU/mL）的DNA提取液，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測會出現(xiàn)588bp的擴增產(chǎn)物（圖4）。結果表明，普通PCR方法在稀釋度為10-3時就沒有擴增產(chǎn)物即檢測靈敏度為6×103CFU/mL。由此可以看出，CPA反應的靈敏度是普通PCR的10倍。3討論傳統(tǒng)分離鑒定法檢測霍亂弧菌至少需要十幾個小時才能完成，耗時較長。最近幾年發(fā)展起來的熒光定量PCR方法、普通PCR方法等分子生物學方法由于受到儀器和設備的限制，雖然效果較好，但很難在基層大范圍推廣使用。因此需要建立一種靈敏度高、特異性強、簡便、快速、便于在基層大規(guī)模推廣的霍亂弧菌的檢測技術。

2013年第7期171秦強等：CPA-核酸試紙條快速檢測霍亂弧菌方法的建立與優(yōu)化CPA方法是一種新穎的恒溫擴增方法，具有很高的特異性和靈敏度，而且它是在恒溫下進行擴增反應，儀器設備簡單，只需能夠保持恒定的溫度即可。本研究把CPA方法與核酸試紙條檢測方法結合起來，不需要通過電泳，可直接用核酸試紙條檢測擴增結果，簡便、快速，對于霍亂疫情的的應急診斷和監(jiān)測具有重要意義�；魜y弧菌的mdh管家基因在不同的群型中具有高度的保守性，是作為靶基因的理想選擇。本實驗以mdh為靶基因，經(jīng)過精確的引物設計、探針設計和對反應體系及反應條件的優(yōu)化，建立了霍亂弧菌CPA-核酸試紙條快速檢測方法。引物和探針的特異性和反應濃度對該方法的特異性和靈敏度起著決定性的作用，本試驗根據(jù)目的序列的5個不同的區(qū)域設計了兩對引物和兩條探針，通過改變反應溫度、BstDNAPolymerase的量、Betaine濃度、MgSO4濃度、引物和探針濃度進行反應體系的優(yōu)化，最終確立了20μL的CPA的最佳反應體系，反應溫度為63℃，60min即可完成反應，通過核酸試紙條可以直接判定反應結果，試驗過程快速、簡便。使用本研究的霍亂弧菌CPA-核酸試紙條快速檢測方法檢測實驗室保存的霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌的結果與已知的菌株信息一致，證明該方法具有良好的特異性。將已知濃度的霍亂弧菌（ATCC14035）（6×105CFU/mL）菌液根據(jù)菌體濃度（CFU值）進行進行10n的倍比稀釋，用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，CPA-核酸試紙條法進行檢測，檢測的靈敏度達到了10-3即6×102CFU/mL，說明此方法具有較高的靈敏度。用普通PCR方法擴增不同稀釋度的霍亂弧菌（ATCC14035）（6×105CFU/mL）?

【參考文獻】：
期刊論文
[1]DNA環(huán)介導恒溫擴增技術快速檢測霍亂弧菌[J]. 徐義剛,李蘇龍,李丹丹,張洪祥,姜艷春.  生物工程學報. 2010(03)
[2]不同群型霍亂弧菌recA、dnaE和mdh管家基因序列分析[J]. 芮勇宇,闞飆,高守一,劉延清,祁國明.  南方醫(yī)科大學學報. 2006(12)



本文編號：3301491