用交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Cross priming amplification,CPA）和核酸試紙條檢測(cè)方法（Nucleic acid test strip detection methord）快速檢測(cè)霍亂弧菌。根據(jù)霍亂弧菌的MDH基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物和探針,通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系與反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,確立最佳反應(yīng)體系,并將CPA方法與PCR法進(jìn)行比較與評(píng)價(jià)。對(duì)霍亂弧菌的檢測(cè)具有高度特異性,對(duì)霍亂弧菌的檢出極限達(dá)到了6×102CFU/mL,高于PCR,而且具有較好的穩(wěn)定性。交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Cross priming amplification,CPA）-核酸試紙條檢測(cè)方法（Nucleic acid test strip detection methord）是一種特異、靈敏、快速、簡(jiǎn)便的霍亂弧菌的檢測(cè)方法。 

【文章來(lái)源】：生物技術(shù)通報(bào). 2013,(07)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【部分圖文】：

可行性驗(yàn)證試紙條結(jié)果圖

lyticus（ATCC17802）-Vibrioparahaemolyticus（ATCC27519）-Vibrioalginolyticus（ATCC33787）-Vibrioalginolyticus（ATCC17749）-Escherichiacoli（ATCC25922）-Staphylococcusaureus（ATCC25923）-2.4靈敏度試驗(yàn)結(jié)果用霍亂弧菌CPA-核酸試紙條快速檢測(cè)方法的最佳反應(yīng)體系擴(kuò)增不同稀釋度的霍亂弧菌（ATCC14035）（6×105CFU/mL），從試紙條結(jié)果看，隨著模板濃度的降低，至稀釋度為10-4時(shí)，沒(méi)有出現(xiàn)檢測(cè)線，說(shuō)明此方法的檢測(cè)靈敏度為起始菌液濃度的10-3即6×102CFU/mL。從電泳結(jié)果（圖3）可以看出，隨著模板濃度的降低，至稀釋度為10-4時(shí)沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，與試紙條的結(jié)果一致。1：10-1；2：10-2；3：10-3；4：10-4；5：陰性對(duì)照；M：marker圖3靈敏度試驗(yàn)試紙條結(jié)果（A）以及靈敏度試驗(yàn)電泳結(jié)果（B）2.5普通PCR方法與CPA方法的比較結(jié)果用普通PCR方法擴(kuò)增不同稀釋度的霍亂弧菌（ATCC14035）（6×105CFU/mL）的DNA提取液，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)會(huì)出現(xiàn)588bp的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖4）。結(jié)果表明，普通PCR方法在稀釋度為10-3時(shí)就沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物即檢測(cè)靈敏度為6×103CFU/mL。由此可以看出，CPA反應(yīng)的靈敏度是普通PCR的10倍。3討論傳統(tǒng)分離鑒定法檢測(cè)霍亂弧菌至少需要十幾個(gè)小時(shí)才能完成，耗時(shí)較長(zhǎng)。最近幾年發(fā)展起來(lái)的熒光定量PCR方法、普通PCR方法等分子生物學(xué)方法由于受到儀器和設(shè)備的限制，雖然效果較好，但很難在基層大范圍推廣使用。因此需要建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、快速、便于在基層大規(guī)模推廣的霍亂弧菌的檢測(cè)技術(shù)。

2013年第7期171秦強(qiáng)等：CPA-核酸試紙條快速檢測(cè)霍亂弧菌方法的建立與優(yōu)化CPA方法是一種新穎的恒溫?cái)U(kuò)增方法，具有很高的特異性和靈敏度，而且它是在恒溫下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，只需能夠保持恒定的溫度即可。本研究把CPA方法與核酸試紙條檢測(cè)方法結(jié)合起來(lái)，不需要通過(guò)電泳，可直接用核酸試紙條檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，簡(jiǎn)便、快速，對(duì)于霍亂疫情的的應(yīng)急診斷和監(jiān)測(cè)具有重要意義�；魜y弧菌的mdh管家基因在不同的群型中具有高度的保守性，是作為靶基因的理想選擇。本實(shí)驗(yàn)以mdh為靶基因，經(jīng)過(guò)精確的引物設(shè)計(jì)、探針設(shè)計(jì)和對(duì)反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了霍亂弧菌CPA-核酸試紙條快速檢測(cè)方法。引物和探針的特異性和反應(yīng)濃度對(duì)該方法的特異性和靈敏度起著決定性的作用，本試驗(yàn)根據(jù)目的序列的5個(gè)不同的區(qū)域設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物和兩條探針，通過(guò)改變反應(yīng)溫度、BstDNAPolymerase的量、Betaine濃度、MgSO4濃度、引物和探針濃度進(jìn)行反應(yīng)體系的優(yōu)化，最終確立了20μL的CPA的最佳反應(yīng)體系，反應(yīng)溫度為63℃，60min即可完成反應(yīng)，通過(guò)核酸試紙條可以直接判定反應(yīng)結(jié)果，試驗(yàn)過(guò)程快速、簡(jiǎn)便。使用本研究的霍亂弧菌CPA-核酸試紙條快速檢測(cè)方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室保存的霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌的結(jié)果與已知的菌株信息一致，證明該方法具有良好的特異性。將已知濃度的霍亂弧菌（ATCC14035）（6×105CFU/mL）菌液根據(jù)菌體濃度（CFU值）進(jìn)行進(jìn)行10n的倍比稀釋，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，CPA-核酸試紙條法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的靈敏度達(dá)到了10-3即6×102CFU/mL，說(shuō)明此方法具有較高的靈敏度。用普通PCR方法擴(kuò)增不同稀釋度的霍亂弧菌（ATCC14035）（6×105CFU/mL）?

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)霍亂弧菌[J]. 徐義剛,李蘇龍,李丹丹,張洪祥,姜艷春.  生物工程學(xué)報(bào). 2010(03)
[2]不同群型霍亂弧菌recA、dnaE和mdh管家基因序列分析[J]. 芮勇宇,闞飆,高守一,劉延清,祁國(guó)明.  南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2006(12)



本文編號(hào)：3301491