目的：克隆綿羊肺腺瘤病毒受體hval-2基因全長,將其重組入原核表達載體中,構建重組質粒,進而轉化到BL21（DE3）大腸桿菌中,進行誘導表達,利用親和層析的方法純化出Hyal-2蛋白,制備hyal-2的多克隆抗體,為進一步鑒定JSRV感染的組織細胞,探究JSRV的組織嗜性奠定基礎.方法：本研究根據已報道的hval-2基因序列,經primer5.0軟件設計一對特異性的引物序列,利用PCR方法擴增hval-2基因序列,并將其重組入pGEX-4T-1原核表達載體中,構建pGEX-4T-1-hyal-2重組質粒,進行菌液PCR及測序,鑒定重組質粒構建的正確性。將其轉化到大腸桿菌BL21（DE3）中,經IPTG誘導后進行10%SDS-PAGE電泳分析,檢測融合蛋白的表達情況,經Western blotting驗證融合蛋白的表達。為了使GST-Hyal-2融合蛋白大量、穩(wěn)定、高效地表達,本試驗分別對重組菌表達GST-Hyal-2融合蛋白的IPTG誘導濃度、誘導時間、溫度進行了優(yōu)化,摸索最佳的表達條件。進而利用谷胱甘肽親和層析的方法對目的蛋白進行親和純化,將純化后的目的蛋白免疫家兔,制備Hval-... 

【文章來源】：內蒙古農業(yè)大學內蒙古自治區(qū)

【文章頁數】：62 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

PGEX-4T-1載體圖譜

內蒙古農業(yè)大學碩士學位論文 21_1 M■ top.2000i1000750500250100圖2. 基因PCR擴増產物電泳結果Fig 2. PCR amplification results of hyal-2 gene注：1. PCR 擴增產物；M.DL2000 DNA Marker。2.3.2菌液PCR檢測結果將重組質粒轉化入宿主菌DH5a大腸桿菌，倒置培養(yǎng)后，隨機挑取8個單克隆菌落進行菌液PCR鑒定，其中除7號為陰性外，其余均為陽性（如圖3所示），菌液PCR鑒定為陽性的2、6號菌液送測序鑒定。！1 2 3 4. 5 6 Y 8 Mm————圖3.菌液PCR鑒定結果Fig 3. Bacteria iclentincation results of PCR注：1?8.隨機挑取的8個申.Si落2.3.3 /7>^3/-^?基因的序列分析利用DNAStar對測序結果進行分析，,顯示/7737-2基因全長為1431 bp,通過Blast序列比對分析發(fā)現與己報道的力/ai-2基因（JX231101.1)的核苷酸同源性為100%，應用DNAStar生物信息學軟件分析發(fā)現hya.l」l基因編碼476個氨基酸,蛋白分子量為54. 2 ku，測序結果及編碼的氧基酸序列如下圖：I

圖3.菌液PCR鑒定結果Fig 3. Bacteria iclentincation results of PCR注：1?8.隨機挑取的8個申.Si落3 /7>^3/-^?基因的序列分析

【參考文獻】：
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本文編號：3300176