豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）是一種引起豬嚴(yán)重呼吸道癥狀的傳染病病原菌,可以引發(fā)豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia, PCP）;在近幾年的文獻(xiàn)報(bào)道中發(fā)現(xiàn),研發(fā)主要毒力基因缺失的弱毒疫苗菌株已經(jīng)成為了研究防治該病的主要方向。本試驗(yàn)以APP單基因缺失株SW1A Ⅱ C為親本株,構(gòu)建了同時(shí)缺失ApxⅠC以及ApxⅡC的雙基因缺失突變株SW1ΔⅠC/ΔⅡC,并對(duì)其生物學(xué)特性和免疫原性進(jìn)行相關(guān)研究。1、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌SW1ΔIC/ΔIIC的構(gòu)建1.1同源重組載體pBOSKΔⅡC的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物以本實(shí)驗(yàn)室分離的APP血清5型SW1株基因組為模板擴(kuò)增ApxⅡC基因上游2654bp和下游2039bp序列TA克隆至pMD19-T,經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定正確后,通過(guò)SacⅠ、SaiⅠ位點(diǎn)酶切連接至載體pBS-OSK,作為其左、右同源臂,通過(guò)PCR和酶切鑒定,試驗(yàn)成功構(gòu)建了缺失451bp的ApxⅡC基因的APP血清5型SW1株重組轉(zhuǎn)移載體pBOSKΔⅡC。1.2 APP雙基因ApxⅠ... 

【文章來(lái)源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖８突變株ＳＷＩＡＩＣ／ＡＩＩＣ正向篩選的鑒定

鑒定結(jié)果可得，一條約為７〇〇ｂｐ左右條帶（是含有完整ＡｐｘＩｌＣ的７３８ｂｐ條帶）??和一條３００ｂｐ左右的條帶（是缺失了?ＡｐｘＩＩＣ基因的上下游同源臂之間的片段），??該結(jié)果證明第一次同源重組正確（如圖８）。??３．２．２?ＡＰＰ重組菌的負(fù)向篩選??將上一步驟篩選得到的重組苗液在無(wú)抗性的Ｔ泌培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)促進(jìn)其??第二次同源重組，然后將菌液涂布于含有１０％薦糖的ＴＳＡ培養(yǎng)基中置于３７‘Ｃ恒??溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，待平板上長(zhǎng)出菌落，則對(duì)該苗落利用引物ＰＣ－１和ＰＣ－２進(jìn)??行ＰＣＲ鑒定，結(jié)果得到一條大小約為３００ｂｐ左右的條帶（單拷貝），征明ＰＣＲ??擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期相符（如圖９），并說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建突變株ＳＷ１Ａ?Ｉ?Ｃ／ＡＩＩＣ。??３４??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]嵌合Hps外膜蛋白P2基因的APP缺失突變株△apxIC/ompP2的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究[D]. 龔雨恒.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011



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