豬嵴病毒（Porcine kobuvirus）是微小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）嵴病毒屬（Kobuvirus）成員。2008年,匈牙利學者首次報道在無臨床癥狀表現(xiàn)的豬糞便中發(fā)現(xiàn)豬嵴病毒；2009年,在中國豬群中也檢出了豬嵴病毒。自此之后,多個國家報道在豬群中檢測到豬嵴病毒,包括泰國、日本、韓國、荷蘭、巴西、西班牙、意大利、東非等。豬嵴病毒是一種具有傳染性、在世界范圍內(nèi)廣泛分布的新型病毒,在腹瀉豬中有較高檢出率,認為可能是豬腹瀉的病原,但鑒于其在沒有腹瀉的豬群中也普遍存在,且目前尚未能實現(xiàn)體外分離培養(yǎng),需要更多的研究來闡明其生物學特性及病原特性。本研究旨在對四川地區(qū)豬嵴病毒病流行情況進行調(diào)查,并對四川株豬嵴病毒VP1基因分子流行病學特點進行分析；VP1蛋白是嵴病毒暴露在最外面的結構蛋白,是嵴病毒的優(yōu)勢免疫蛋白,本研究通過大腸桿菌表達系統(tǒng),表達豬嵴病毒VP1蛋白優(yōu)勢抗原表位區(qū),利用純化的重組蛋白建立一種檢測豬血清中豬嵴病毒抗體的間接ELISA方法,為今后豬嵴病毒血清學診斷方法的研究奠定基礎。本研究在2011-2012年從四川豬場中收集了163份豬糞便和腸道組織樣品,其中1... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略詞表
第一部分 文獻綜述
    1 嵴病毒的發(fā)現(xiàn)及生物學分類
    2 嵴病毒形態(tài)學結構和基因組結構
    3 嵴病毒基因組及其編碼的蛋白質(zhì)
    4 嵴病毒生物學特性
    5 嵴病毒流行病學
        5.1 人愛知病毒
        5.2 牛嵴病毒
        5.3 豬嵴病毒
    6 嵴病毒的實驗室診斷
    本研究的目的與意義
第二部分 實驗部分
    第一章 2011-2012年四川地區(qū)豬群豬嵴病毒感染情況.調(diào)查及豬嵴病毒VP1基因分子流行病學調(diào)查分析
        1 材料與試劑
            1.1 實驗試劑
            1.2 實驗儀器
            1.3 溶液及配制
            1.4 臨床樣品
            1.5 菌株
        2 實驗方法
            2.1 引物合成
            2.2 樣品的處理及總RNA提取
            2.3 反轉錄制備cDNA
            2.4 豬嵴病毒PCR檢測
            2.5 生物統(tǒng)計學分析
            2.6 豬嵴病毒VP1基因擴增
            2.7 目的DNA片段的回收
            2.8 分子克隆
            2.9 豬嵴病毒多聚蛋白基因的基因多樣性分析
            2.10 序列相似性分析和系統(tǒng)進化樹分析
            2.11 重組分析
        3 實驗結果
            3.1 豬嵴病毒3D基因的RT-PCR擴增
            3.2 豬嵴病毒抗原RT-PCR檢測結果
            3.3 生物統(tǒng)計分析結果
            3.4 豬嵴病毒VP1基因擴增結果
            3.5 豬嵴病毒多聚蛋白基因的基因多樣性分析結果
            3.6 系統(tǒng)進化樹分析結果
            3.7 重組分析結果
        4 討論分析
    第二章 豬嵴病毒VP1基因生物信息學分析與蛋白優(yōu)勢抗原表位區(qū)域的原核表達
        1 材料和試劑
            1.1 實驗試劑
            1.2 實驗器材
            1.3 溶液及配置
            1.4 菌種及載體
            1.5 陽性血清和陰性血清
        2 實驗方法
            2.1 豬嵴病毒VP1基因生物信息學分析
            2.2 豬嵴病毒VP1基因優(yōu)勢抗原表位密碼子優(yōu)化與基因合成
            2.3 豬嵴病毒VP1蛋白優(yōu)勢抗原表位區(qū)PCR引物設計與合成
            2.4 豬嵴病毒VP1蛋白優(yōu)勢抗原表位PCR擴增
            2.5 豬嵴病毒VP1蛋白優(yōu)勢抗原表位克隆測序與鑒定
            2.6 豬嵴病毒VP1蛋白優(yōu)勢抗原表位原核表達載體的構建
            2.7 BL21(DE3)-pET32-VP1原核表達菌的誘導表達與表達條件優(yōu)化
            2.8 重組蛋白的大量表達與純化
            2.9 Western-blot檢測
        3 實驗結果
            3.1 豬嵴病毒VP1基因生物信息學分析結果
            3.2 密碼子優(yōu)化結果
            3.3 豬嵴病毒VP1蛋白優(yōu)勢抗原表位PCR擴增結果
            3.4 豬嵴病毒VP1蛋白優(yōu)勢抗原表位TA克隆與鑒定結果
            3.5 BL21(DE3)-pET32-VP1原核表達菌菌株構建
            3.6 BL21(DE3)-pET32-VP1原核表達菌的誘導表達
            3.7 BL21(DE3)-pET32-VP1原核表達條件優(yōu)化結果
            3.8 BL21(DE3)-PET32-VP1原核表達重組蛋白可溶性檢測
            3.9 BL21(DE3)-pET32-VP1原核表達重組蛋白的純化
            3.10 重組表達蛋白Western-blot檢測結果
        4 討論分析
    第三章 豬嵴病毒抗體檢測間接ELISA方法的建立與初步應用
        1 材料和試劑
            1.1 實驗試劑
            1.2 實驗器材
            1.3 溶液及配置
            1.4 血清樣品
        2 實驗方法
            2.1 純化重組蛋白濃度測定
            2.2 間接ELISA方法的基本操作程序
            2.3 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)的確定
            2.4 抗原包被條件的確定
            2.5 封閉液的選擇以及封閉時間的確定
            2.6 血清樣品最適作用時間的確定
            2.7 酶標二抗工作濃度和作用時間的優(yōu)化
            2.8 底物作用時間的優(yōu)化
            2.9 臨界值的確定
            2.10 特異性實驗
            2.11 重復性實驗
            2.12 臨床樣本的檢測
        3 實驗結果
            3.1 純化重組蛋白濃度測定結果
            3.2 間接ELISA檢測方法的建立
            3.3 臨床樣本的檢測
        4 討論分析
結論
參考文獻
致謝
攻讀碩士學位之間發(fā)表的學術論文


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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[2]河南豬嵴病毒分子流行病學調(diào)查、全基因序列分析、VP1蛋白表達及其初步應用[D]. 姬郭彪.河南農(nóng)業(yè)大學 2013
[3]豬嵴病毒VP1基因克隆與表達及抗體檢測ELISA方法的建立[D]. 田野.揚州大學 2013



本文編號：3294820