發(fā)布時(shí)間：2021-07-20 19:42

　　本試驗(yàn)用基因克隆、測(cè)序、.雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和干擾RNA等方法,研究了豬MITF-M基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域序列及其轉(zhuǎn)錄活性與功能,得到了如下結(jié)果：1、從藏豬基因組中調(diào)取了含有MITF基因的scarffords,將其作為參考序列設(shè)計(jì)了3對(duì)相互重疊的引物,通過(guò)PCR克隆測(cè)序,首次獲得豬MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)約7.8kb的序列。2、根據(jù)測(cè)序得到的MITF-M調(diào)控區(qū)序列設(shè)計(jì)引物,利用“巢式”PCR克隆轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域片段,通過(guò)酶切、連接、轉(zhuǎn)化,成功構(gòu)建并驗(yàn)證了豬MITF-M基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的10段5’端缺失報(bào)告基因載體:PGL3-1140、PGL3-1397、PGL3-2470、PGL3-3487、 PGL3-3753、PGL3-5201、PGL3-5429、PGL3-6036、PGL3-6274、PGL3-6416。3、將所構(gòu)建的10個(gè)載體轉(zhuǎn)染到B16細(xì)胞,48小時(shí)后,利用雙熒光素報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)10個(gè)載體的熒光素酶活性,確定了MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)存在兩個(gè)重要核心區(qū)域,分別位于-2470-3487 bp的負(fù)調(diào)控區(qū)和-5429～-6036 bp的正調(diào)控區(qū)。4、利用轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)軟件JASPAR和干擾RNA... 

【文章來(lái)源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：62 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
符號(hào)說(shuō)明
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)的發(fā)現(xiàn)
    1.2 MITF的結(jié)構(gòu)與功能
    1.3 MITF的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后修飾和信號(hào)通路
    1.4 MITF調(diào)控的靶基因
    1.5 MITF與黑色素形成的關(guān)系
        1.5.1 MITF突變與黑色素的缺失
        1.5.2 MITF調(diào)控黑色素的形成
    1.7 MITF-M與黑色素細(xì)胞的生存
    1.8 MITF與動(dòng)物毛色的關(guān)系
2 研究?jī)?nèi)容與目的意義
3 材料與方法
    3.1 試驗(yàn)材料
        3.1.1 菌株和載體
        3.1.2 試驗(yàn)樣品和細(xì)胞系
        3.1.3 主要儀器與設(shè)備
        3.1.4 主要試劑
        3.1.5 試劑的配制
        3.1.6 生物信息學(xué)網(wǎng)站和分析軟件
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 豬MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的克隆及重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.2 組織基因組DNA提取
        3.2.3 PCR、酶切產(chǎn)物回收與連接
        3.2.4 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.2.5 重組質(zhì)粒的鑒定
        3.2.6 質(zhì)粒提取
        3.2.7 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.2.9 熒光素酶活性測(cè)定
        3.2.10 B16細(xì)胞RNA提取
        3.2.11 cDNA的制備
        3.2.12 定量PCR
4 結(jié)果與分析
    4.1 基因組DNA提取結(jié)果
    4.2 豬MITF-M基因5'端調(diào)控序列克隆與測(cè)序
    4.3 豬MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域序列分析
        4.3.1 豬MITF-M基因5'端調(diào)控序列保守性分析
        4.3.2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域核心活性區(qū)的預(yù)測(cè)
        4.3.3 CpG島的預(yù)測(cè)
        4.3.4 MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域MEME結(jié)構(gòu)分析
    4.4 豬MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域重組載體構(gòu)建結(jié)果
    4.5 MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域5'缺失載體轉(zhuǎn)染及熒光素活性檢測(cè)
    4.6 MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)
    4.7 KLF4調(diào)控MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性
5. 討論
    5.1 豬MITF-M調(diào)控區(qū)域序列的獲得
    5.2 缺失片段的選擇和克隆
    5.3 甲基化對(duì)轉(zhuǎn)錄活性的影響
    5.4 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)MITF-M轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域活性的影響
    5.5 KLF4對(duì)MITF-M轉(zhuǎn)錄活性的影響
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
附件1：豬MITF-M基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列
附件2：攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Mitf-M在羊駝皮膚組織的表達(dá)與序列分析及免疫組織化學(xué)定位[J]. 朱芷葳,賀俊平,于秀菊,程志學(xué),董常生.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2012(04)
[2]豬Mitf基因的比較基因組學(xué)和進(jìn)化分析[J]. 艾華水,胡小芬,周利華.  生物技術(shù)通報(bào). 2010(07)
[3]KLF4在正常生理活動(dòng)與腫瘤中的作用[J]. 吳釗,王子衛(wèi).  癌變·畸變·突變. 2010(03)



本文編號(hào)：3293463