以小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）疫苗株Nigeria75/1基因序列為基礎(chǔ),構(gòu)建了融合表達(dá)PPRV囊膜蛋白F和H胞外區(qū)的真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-F-H,在懸浮CHO細(xì)胞中進(jìn)行分泌表達(dá)。離心收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行親和層析純化,純化樣品經(jīng)Western-blot鑒定,融合蛋白與PPRV陽(yáng)性血清和His標(biāo)簽抗體都能發(fā)生免疫反應(yīng)。使用純化后的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)PPRV的特異性抗體。上述研究結(jié)果為小反芻獸疫新型亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2020,50(06)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

PPRVF-H基因融合表達(dá)分子設(shè)計(jì)策略Figure1PPRVF-HgeneexpressionmoleculedesignstrategyA：F蛋白信號(hào)肽分析：SignalP4.1Server軟件分析顯示1～19位氨基酸為F蛋白信號(hào)肽；B：F蛋白跨膜區(qū)分析：TMHMMServerv.2.0軟件分析

RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)核酸凝膠電泳鑒定顯示，兩個(gè)擴(kuò)增片段的大小分別約為1650bp和1060bp（見(jiàn)圖2），與預(yù)期大小相符，編碼PPRVF和H蛋白胞外區(qū)的基因得到有效擴(kuò)增。2.2重組克隆質(zhì)粒的雙酶切鑒定如圖3所示，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-F-H經(jīng)AflⅡ＋NotⅠ雙酶切后產(chǎn)生約5000bp和3000bp的2條特異性條帶，酶切產(chǎn)物大小與理論值相符，表明擴(kuò)增的F與H片段正確融合并與載體連接，測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞及鑒定離心收取轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-F-H重組質(zhì)粒和pcDNA3.1空載體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并設(shè)未轉(zhuǎn)染的圖2RT-PCR擴(kuò)增的基因片段的電泳鑒定Figure2IdentificationresultsofgenefragmentsamplifiedbyRT-PCRM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：H蛋白胞外區(qū)基因片段；2：F蛋白胞外區(qū)基因片段。M：DL2000DNAMarker；1：Hproteinextracellularregiongenefrag-ments；2：Fproteinextracellularregiongenefragments.M122000bp1000bp750bp500bp250bp100bp圖3重組克隆質(zhì)粒的雙酶切鑒定Figure3IdentificationofrecombinantcloningplasmidbydoubleenzymedigestionM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：F-H基因；2：F-H基因酶切產(chǎn)物。M：DL12000DNAMarker；1：F-Hgene；2：F-Hgeneenzymedigestionproducts.12M12000bp8000bp6000bp5000bp4000bp3000bp2500bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp707

2h。將待檢血清用血清稀釋液從1∶4開(kāi)始稀釋并加入反應(yīng)孔中，每孔100L，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃孵育1h。HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體用血清稀釋液按1∶5000稀釋后加入反應(yīng)孔中，每孔100L，37℃孵育1h。TMB顯色，每孔50L，顯色10min后，加入每孔50L終止液終止反應(yīng)，讀取D450值。2結(jié)果2.1PPRVH基因和F基因的RT-PCR擴(kuò)增RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)核酸凝膠電泳鑒定顯示，兩個(gè)擴(kuò)增片段的大小分別約為1650bp和1060bp（見(jiàn)圖2），與預(yù)期大小相符，編碼PPRVF和H蛋白胞外區(qū)的基因得到有效擴(kuò)增。2.2重組克隆質(zhì)粒的雙酶切鑒定如圖3所示，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-F-H經(jīng)AflⅡ＋NotⅠ雙酶切后產(chǎn)生約5000bp和3000bp的2條特異性條帶，酶切產(chǎn)物大小與理論值相符，表明擴(kuò)增的F與H片段正確融合并與載體連接，測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞及鑒定離心收取轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-F-H重組質(zhì)粒和pcDNA3.1空載體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并設(shè)未轉(zhuǎn)染的圖2RT-PCR擴(kuò)增的基因片段的電泳鑒定Figure2IdentificationresultsofgenefragmentsamplifiedbyRT-PCRM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：H蛋白胞外區(qū)基因片段；2：F蛋白胞外區(qū)基因片段。M：DL2000DNAMarker；1：Hproteinextracellularregiongenefrag-ments；2：Fproteinextracellularregiongenefragments.M122000bp1000bp750bp500bp250bp100bp圖3重組克隆質(zhì)粒的雙酶切鑒定Figure3IdentificationofrecombinantcloningplasmidbydoubleenzymedigestionM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：F-H基因；2：F-H基因酶切產(chǎn)物。M：DL12000DNAMarker；1：F-Hgene；2：F-Hgeneenzymedigestionproducts.12M12000bp8000bp6000bp5000bp4000bp3000bp2500bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp707

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]小反芻獸疫病毒N蛋白的原核表達(dá)及其多克隆抗體的制備[J]. 周巖巖,李玲霞,吳錦艷,余樹芳,李嬌陽(yáng),劉丹,馮倩,孫晶晶,何苗,魏凡華,尚佑軍.  中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2019(10)
[2]高新技術(shù)疫苗研究的現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)[J]. 尼悅,黨安坤,田召芳,王曉玲.  山東畜牧獸醫(yī). 2016(06)

碩士論文
[1]小反芻獸疫病毒F蛋白與H蛋白相互作用及F蛋白免疫原性研究[D]. 楊香芳.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[2]小反芻獸疫病毒F、H基因的核酸疫苗及N蛋白的原核表達(dá)研究[D]. 阮洋.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[3]含塞姆利基森林病毒復(fù)制子的HIV多表位核酸疫苗的構(gòu)建與表達(dá)[D]. 付延軍.延邊大學(xué) 2007



本文編號(hào)：3292171