為建立快速同步檢測雞源新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒與傳染性支氣管炎病毒的多重RT-PCR檢測方法,并應(yīng)用于臨床檢測。參考GenBank中NDV NP、 IBV N和IBDV VP基因序列,設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物。通過優(yōu)化引物濃度及退火溫度建立多重RT-PCR方法,并進(jìn)行特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示,成功建立了檢測NDV、 IBDV和IBV的三重RT-PCR方法,具有良好的特異性和穩(wěn)定性,只擴(kuò)增出NDV、 IBDV和IBV的特異性片段,對(duì)雞大腸桿菌、雞沙門氏菌、雞巴氏桿菌和雞馬立克等其他無關(guān)病原核酸無擴(kuò)增;對(duì)NDV、 IBDV和IBV核酸最低檢測量分別為NDV6.18×10¹copies/μl、 IBDV 8.64×10⁶copies/μl和IBV2.57×10²copies/μl;用該方法進(jìn)行多次重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果一致。結(jié)果表明,所建立方法對(duì)NDV、 IBDV和IBV的三重RT-PCR方法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好;為雞源新城疫、染性法氏囊與傳染性支氣管炎臨床混合感染病例的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了可靠的方法。 

【文章來源】：中國畜禽種業(yè). 2020,16(11)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

NDV退火溫度優(yōu)化

IBV退火溫度優(yōu)化

本研究參考Gen Bank中雞新城疫、傳染性法氏囊和傳染性支氣管炎相應(yīng)靶基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物。選擇新城疫NP基因，傳染性法氏囊VP基因，傳染性支氣管炎N基因作為靶序列，應(yīng)用Primer Premier5.0分別設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，通過NCBI BLAST比對(duì)和DNAStar軟件分析確保不同引物對(duì)之間沒有同源關(guān)系，不會(huì)形成穩(wěn)定的引物二聚體。分別設(shè)計(jì)3個(gè)目的片段為144bp、429bp、600bp,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后大小之差約在200bp左右，使目的片段分布在Marker不同標(biāo)尺大小的區(qū)域，具有辨識(shí)度，不易造成誤判[21]。多重PCR技術(shù)的反應(yīng)體系較常規(guī)PCR有較高的要求，們?cè)趯?duì)本研究中的每種待檢病毒進(jìn)行普通PCR檢測成功的基礎(chǔ)上，通過不斷優(yōu)化反應(yīng)體系及反應(yīng)程序中的退火溫度，確保每一重的擴(kuò)增效率保持一致，以降低引物二聚體甚至多聚體的形成。且在試驗(yàn)過程中選取了沙門氏菌核酸、大腸桿菌核酸、禽白血病病毒核酸以及禽支原體核酸進(jìn)行特異性檢測，結(jié)果均未檢出這幾類常見禽類病原核酸，證實(shí)了本試驗(yàn)建立的m PCR具有較好的特異性。同時(shí)本研究在單一RT-PCR檢測方法的基礎(chǔ)上，建立了一步法多重RT-PCR，在一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（RT）與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），節(jié)省了時(shí)間和操作步驟，大大提高了病原檢測的效率。在本研究中，不僅可以從組織器官、排泄物、鼻腔拭子以及細(xì)胞培養(yǎng)物等臨床樣本中提取到病毒總RNA，還可以直接從血清、全血等血液樣本中提取出病毒總RNA。本研究建立的一步法多重RT-PCR方法特異性強(qiáng)，敏感性比較高，其最低RNA檢測下限達(dá)到了NDV6.18×101copies/μl、IBDV8.64×106copies/μl和IBV2.57×102copies/μl，可以用來檢測血清中含量較低的NDV、IBDV和IBV，因此，本方法可以用于血清病原篩查，可應(yīng)用于臨床大樣本量的快速檢測。圖5 NDV、IBDV和IBV三重RT-PCR特異性優(yōu)化

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號(hào)：3288824