發(fā)布時間：2021-07-17 10:26

　　綿羊的泌乳性狀是一個重要的經(jīng)濟(jì)性狀,它顯著影響了后代羔羊的成活率和生長速度等性能。乳腺發(fā)育程度以及乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量和分泌活性直接決定了母羊的產(chǎn)奶量和乳成分。microRNA（miRNA）是真核生物中廣泛存在的一類非編碼小RNA分子,它們在動物泌乳性狀調(diào)控方面發(fā)揮了重要作用。課題組前期采集了泌乳高峰期和空懷期小尾寒羊的乳腺組織,進(jìn)行了small RNA-Seq,在兩組間發(fā)現(xiàn)了23個差異表達(dá)miRNAs,其中miR-221和miR-329b-3p在空懷期乳腺中的表達(dá)量顯著上調(diào)。因此,本研究以這兩個miRNAs為研究對象,首先用實(shí)時熒光定量PCR（Reverse Transcription-Quantitative PCR,RT-qPCR）驗(yàn)證了它們的表達(dá)量,用CCK-8試劑盒檢測了它們對綿羊乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響,其次預(yù)測了它們的靶基因,分析了靶基因的GO和KEGG功能富集。最后用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和RT-qPCR等方法,驗(yàn)證了miR-221和miR-329b-3p與預(yù)測靶基因IRS1的靶向關(guān)系,并研究了miR-221和miR-329b-3p對靶基因IRS1及IRS1參與的PI3K/AK... 

【文章來源】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)甘肅省

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

奶牛乳房右前乳區(qū)解剖示意圖[5]

小尾寒羊miR-221和miR-329b-3p功能研究及其與IRS1基因的靶向關(guān)系驗(yàn)證13保存。2.7.1.2pmiR-RB-Report載體圖譜pmiR-RB-Report載體是專門用來檢測miRNA作用的檢測工具。在載體中，以海腎熒光素酶基因作為報(bào)告基因，以螢火蟲熒光素酶基因（hLuc）作為內(nèi)參基因，通過檢測海腎熒光素酶活性的相對變化，來鑒定miRNA對該基因是否有調(diào)控作用。將靶基因的3′UTR區(qū)克隆至載體的海腎熒光素酶基因（hRluc）下游位點(diǎn)，載體圖譜見圖2-1。圖2-1pmiR-RB-Report載體圖譜Figure2-1pmiR-RB-Reportvectoratlas注：hRluc為海腎熒光素酶基因，是報(bào)告基因；hLuc+為螢火蟲熒光素酶基因，是內(nèi)參基因；3′UTRRegion是靶基因3′UTR區(qū)域的連接位點(diǎn)；Ampr是氨芐青霉素抗性基因，用于大腸桿菌陽性克隆子篩眩2.7.1.3擴(kuò)增產(chǎn)物與pmiR-RB-Report載體的酶切及純化（1）擴(kuò)增產(chǎn)物的純化將IRS1基因3′UTR的擴(kuò)增產(chǎn)物（或酶切產(chǎn)物）加水補(bǔ)充到100μL，加入500μL的BufferGDP，顛倒或渦旋混勻后加入到吸附柱中，將吸附柱套在收集管中，在12000rpm下離心1min。棄濾液，把吸附柱置于收集管中。加入700μLBufferGW（含無水乙醇）至吸附柱中，12000rpm下離心1min（重復(fù)此操作1次）。棄濾液，把吸附柱置于收集管中，12000rpm下離心2min。將吸附柱置于在1.5mL滅菌的離心管中，加入20μLElutionBuffer至吸附柱中央，放置2min，12000rpm下離心1min。棄去吸附柱，把DNA保存于-20℃。（2）酶切將純化產(chǎn)物與pmiR-RB-Report載體分別置于PCR管中，加入內(nèi)切酶酶切（酶切體系見表2-5），輕輕混勻后瞬時離心，置于37℃恒溫水浴鍋中水浴10min。

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2020屆碩士學(xué)位論文20第三章結(jié)果與分析1綿羊乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定1.1綿羊乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)采用膠原酶I消化乳腺的實(shí)質(zhì)部分后，得到了大量的細(xì)胞。根據(jù)成纖維細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞對胰酶的耐受性不同，來分離和純化乳腺上皮細(xì)胞。純化后的綿羊乳腺上皮細(xì)胞用全培養(yǎng)液培養(yǎng)，具體生長過程為：第一天，綿羊乳腺上皮細(xì)胞生長緩慢、細(xì)胞體積校第三天，細(xì)胞體積變大，開始聚集生長。第四天，細(xì)胞大量增殖，有的細(xì)胞聚集在一起形成閉合的細(xì)胞群，呈“島嶼狀”生長，此時細(xì)胞已經(jīng)鋪滿了培養(yǎng)板的50%。第五天，細(xì)胞繼續(xù)增殖，成群生長，鋪滿了培養(yǎng)板的80%，呈現(xiàn)出明顯的“鋪路石”狀（圖3-1）。圖3-1綿羊乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)（100×）Figure3-1Thecultivationoftheovinemammaryglandepithelialcells（100×）1.2綿羊乳腺上皮細(xì)胞鑒定熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：在原代培養(yǎng)的細(xì)胞中，乳腺上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白（角蛋白18,Keratin18）在細(xì)胞質(zhì)中呈陽性表達(dá)（圖3-2A），而成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白（波形蛋白,Vimentin）在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核（藍(lán)色）中均不表達(dá)（圖3-2B）。這表明本試驗(yàn)獲得了純的綿羊乳腺上皮細(xì)胞，可以作為后續(xù)的研究材料。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]miR-25 modulates triacylglycerol and lipid accumulation in goat mammary epithelial cells by repressing PGC-1beta[J]. Liuan Ma,Huiling Qiu,Zhi Chen,Li Li,Yan Zeng,Jun Luo,Deming Gou.  Journal of Animal Science and Biotechnology. 2018(04)
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博士論文
[1]奶山羊乳腺能量代謝研究[D]. 張娜.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010

碩士論文
[1]pik3r1通過PI3K-AKT-mTOR通路影響小鼠子宮內(nèi)膜的蛻膜化進(jìn)程[D]. 倪明云.重慶醫(yī)科大學(xué) 2018
[2]Wnt信號通路激活劑BIO在山羊乳腺上皮細(xì)胞形成腺泡樣結(jié)構(gòu)中的調(diào)控作用[D]. 孟凱.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2015
[3]MiR-200a對奶山羊乳腺上皮細(xì)胞脂代謝的調(diào)控作用研究[D]. 張犁蘋.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2013



本文編號：3287992