將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）分別與濁度信號(hào)檢測系統(tǒng)（turbidimeter）和熒光信號(hào)檢測系統(tǒng)（fluorescence）相結(jié)合,建立了LAMP-濁度/熒光單核細(xì)胞增生性李斯特菌檢測方法。選擇單核細(xì)胞增生性李斯特菌保守毒力基因iap序列,通過環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物設(shè)計(jì)在線軟件設(shè)計(jì)4條特異性引物,進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化,并對(duì)建立的LAMP的特異性和靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)分析。結(jié)果表明,構(gòu)建的LAMP-濁度信號(hào)檢測方法優(yōu)化后的擴(kuò)增溫度為61℃,菌液最低檢測濃度為22.1 CFU/mL,靈敏度是普通PCR擴(kuò)增方法的10倍;LAMP-熒光信號(hào)檢測方法優(yōu)化后的擴(kuò)增溫度為64℃,菌液最低檢測濃度為2.21 CFU/mL,靈敏度是普通PCR擴(kuò)增方法的100倍;建立的兩種LAMP方法的特異性良好,其中1株單核細(xì)胞增生性李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和1株本試驗(yàn)分離保存的單核細(xì)胞增生性李斯特菌檢測結(jié)果均為陽性,8株非單核細(xì)胞增生性李斯特菌檢測結(jié)果均為陰性。利用兩種LAMP方法對(duì)630份肉類及其制品、人工污染樣品等進(jìn)行檢測,檢出45個(gè)LAMP陽性,與國標(biāo)法（GB）檢測結(jié)果一致。結(jié)果表明,建立優(yōu)化的單核細(xì)胞增生性李斯特菌LAMP-... 

【文章來源】：動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2020,41(07)北大核心

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

在64 ℃ LAMP-熒光信號(hào)檢測方法擴(kuò)增

利用恒溫(濁度)擴(kuò)增基因檢測系統(tǒng)進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增,同時(shí)對(duì)濁度信號(hào)監(jiān)測,由圖1可以看出,反應(yīng)進(jìn)行30 min內(nèi),分別在60 ℃～65 ℃ 6個(gè)溫度擴(kuò)增時(shí),濁度值均明顯上升,說明有目的片段的擴(kuò)增,濁度信號(hào)出峰時(shí)間最早,Tm值為25:28,61 ℃時(shí)的擴(kuò)增曲線見圖1。因此,LAMP-濁度信號(hào)檢測方法選擇61 ℃作為后續(xù)試驗(yàn)的反應(yīng)溫度。利用OptiGene基因擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng),整個(gè)過程進(jìn)行熒光信號(hào)監(jiān)測,圖2可以看出,反應(yīng)進(jìn)行30 min內(nèi),分別在60 ℃～65 ℃ 6個(gè)溫度擴(kuò)增時(shí),熒光信號(hào)均明顯上升,同時(shí)反應(yīng)在64 ℃時(shí)熒光信號(hào)出峰時(shí)間最早(圖2),峰值為21:29。因此,LAMP-熒光信號(hào)檢測方法選擇64 ℃作為后續(xù)試驗(yàn)的反應(yīng)溫度。

單核細(xì)胞增生性李斯特菌液原濃度為(229+207+228)/3×104×10=2.21×107 CFU/mL,對(duì)菌液做10倍系列稀釋(表3),當(dāng)用濁度儀檢測時(shí),當(dāng)菌液在107～101稀釋范圍內(nèi)均出現(xiàn)濁度的明顯變化,呈LAMP陽性,因此,LAMP-濁度信號(hào)檢測方法菌液最低檢出濃度為22.1 CFU/mL。由表4可知,當(dāng)用熒光檢測儀檢測時(shí),菌液在107～100稀釋范圍內(nèi)均出現(xiàn)熒光信號(hào)的明顯變化,呈LAMP陽性。因此,LAMP-熒光信號(hào)檢測方法菌液最低檢出濃度為2.21 CFU/mL。由圖5可知,當(dāng)稀釋范圍在107～103時(shí),均會(huì)出現(xiàn)204 bp的PCR擴(kuò)增特異性條帶。因此,PCR擴(kuò)增最低菌液檢出濃度為221 CFU/mL。圖4 LAMP-熒光信號(hào)檢測方法特異性試驗(yàn)

【參考文獻(xiàn)】：
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