狂犬病病毒（Rabies virus, RV）是彈狀病毒科狂犬病病毒屬的成員,是一類高度嗜神經性病毒,能導致所有溫血動物高致死性疾病。目前狂犬病的致病機理尚未清楚,無治療方法,只能通過加強疫苗預防予以控制,因此深入研究其致病機制,尋找新的途徑來預防和治療尤為重要。miRNA是一類內源性、長約為21-23nt的非編碼蛋白的單鏈小分子RNA,通過與靶基因完全和不完全配對起到降解mRNA或抑制mRNA翻譯的功能,是一類重要的基因調節(jié)子。它在機體的基因表達調控、細胞分化、細胞凋亡及抗病毒防御中發(fā)揮著重要作用。本實驗用正常和感染了狂犬病病毒GX01的小鼠脊髓組織抽提總RNA,構建Small RNA文庫并上機測序分析后,獲得病毒感染前后小鼠脊髓miRNA的表達譜,其中表達上調3倍以上的有4個：miR-34a-3p、 miR-155-5p、miR-223-3p和miR-223-5p;表達下調3倍以上的只有1個miR-193b-5p。對這5個差異表達的miRNA進行靶基因預測后再進行KEGG pathway分析,同時也用計算機預測并驗證獲得了139個新的miRNA與狂犬病病毒感染有關。在此基礎上,本實... 

【文章來源】：廣西大學廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數】：98 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

樣品總RNA電泳圖

3.1.3顯著差異micRNA的聚類分析對5個表達顯著差異的miRNA進行表達譜聚類分析，miRNA聚類圖見圖3-2，圖中紅色表示經過處理后基因的表達值大于0，綠色表示經過處理后基因的表達值小于0，黑色表示經過處理后基因的RPKM值為0。Mock GXOlInnmu-miR-l93b-5|：mmu-miR-155-60mmu-miR-223-3p1^3.00mmu-miR-34a-3p 腸"2 00■-1 00fSS網2 00…nn圖3-2表達差異的5個miRNA聚類圖Fig. 3-2 Differential expression of five miRNA clustering diagram32

上調趨勢；而qRT-PCR法miR-34a-3p的表達差異倍數為0.947倍，與Solexa測序法的差異倍數的3.079倍并未相符。兩種方法的定量倍數結果的比較見圖3-7:12 r I:： i I w力 IH a qRT-PCR￡ 4 - r-m :01rL, _‘IBimiR-34a-3p miR-155-5p raiR-223-3p圖3-7兩種方法對miRNA基因定量的比較Fig. 3-7 The contrast of the two methods to quantify the genes of miRNA3.3 miRNAs重組質粒的構建收集小it的脊髓組織用于基因組DNA的提取，用各目的基因的特異性引物經過PCR擴增獲得miR-lOlc、miR-155和miR-223的初級轉錄物片段，大小分別為447 bp、359bp和514bp，結果見圖3-8。將目的片段進行膠回收后連接PMD-18T vector，并轉化ToplO感受態(tài)細胞，蹄選陽性克隆，菌液PCR結果見圖3-9,結果表明挑選的單克隆均能擴增到與目的基因大小一致的基因片段。送測序分析正確后抽提質粒，并用含Xhol和BamH I酶切位點的各目的基因的特異性引物進行亞克隆。亞克隆質粒通過測序分析正確后，用Xho I和BamH I限制性內切酶分別雙酶切Y-miR-lOlc、Y-miR-lSS.39

【參考文獻】：
期刊論文
[1]廣西流行狂犬病毒糖蛋白基因的遺傳性分析[J]. 楊健,張紅普,章民,李曉寧,何曉霞,謝琳娟,陸專靈,韋顯凱,唐海波,羅廷榮.  南方農業(yè)學報. 2012(10)
[2]MicroRNA作用機制研究的新進展[J]. 趙爽,劉默芳.  中國科學（C輯:生命科學）. 2009(01)
[3]廣西狂犬病病毒分子流行病學研究[J]. 莫兆軍,李浩,陶小燕,黃莉榮,周開姣,閉福銀,楊進業(yè),唐青.  應用預防醫(yī)學. 2007(05)
[4]狂犬病毒生物學特征研究進展[J]. 熊成龍,張永振,盧思奇.  中華流行病學雜志. 2006(10)



本文編號：3278950