狂犬病病毒（Rabies virus, RV）是彈狀病毒科狂犬病病毒屬的成員,是一類高度嗜神經(jīng)性病毒,能導(dǎo)致所有溫血?jiǎng)游锔咧滤佬约膊�。目前狂犬病的致病機(jī)理尚未清楚,無治療方法,只能通過加強(qiáng)疫苗預(yù)防予以控制,因此深入研究其致病機(jī)制,尋找新的途徑來預(yù)防和治療尤為重要。miRNA是一類內(nèi)源性、長(zhǎng)約為21-23nt的非編碼蛋白的單鏈小分子RNA,通過與靶基因完全和不完全配對(duì)起到降解mRNA或抑制mRNA翻譯的功能,是一類重要的基因調(diào)節(jié)子。它在機(jī)體的基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡及抗病毒防御中發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)用正常和感染了狂犬病病毒GX01的小鼠脊髓組織抽提總RNA,構(gòu)建Small RNA文庫并上機(jī)測(cè)序分析后,獲得病毒感染前后小鼠脊髓miRNA的表達(dá)譜,其中表達(dá)上調(diào)3倍以上的有4個(gè)：miR-34a-3p、 miR-155-5p、miR-223-3p和miR-223-5p;表達(dá)下調(diào)3倍以上的只有1個(gè)miR-193b-5p。對(duì)這5個(gè)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)后再進(jìn)行KEGG pathway分析,同時(shí)也用計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)并驗(yàn)證獲得了139個(gè)新的miRNA與狂犬病病毒感染有關(guān)。在此基礎(chǔ)上,本實(shí)... 

【文章來源】：廣西大學(xué)廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：98 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

樣品總RNA電泳圖

3.1.3顯著差異micRNA的聚類分析對(duì)5個(gè)表達(dá)顯著差異的miRNA進(jìn)行表達(dá)譜聚類分析，miRNA聚類圖見圖3-2，圖中紅色表示經(jīng)過處理后基因的表達(dá)值大于0，綠色表示經(jīng)過處理后基因的表達(dá)值小于0，黑色表示經(jīng)過處理后基因的RPKM值為0。Mock GXOlInnmu-miR-l93b-5|：mmu-miR-155-60mmu-miR-223-3p1^3.00mmu-miR-34a-3p 腸"2 00■-1 00fSS網(wǎng)2 00…nn圖3-2表達(dá)差異的5個(gè)miRNA聚類圖Fig. 3-2 Differential expression of five miRNA clustering diagram32

上調(diào)趨勢(shì)；而qRT-PCR法miR-34a-3p的表達(dá)差異倍數(shù)為0.947倍，與Solexa測(cè)序法的差異倍數(shù)的3.079倍并未相符。兩種方法的定量倍數(shù)結(jié)果的比較見圖3-7:12 r I:： i I w力 IH a qRT-PCR￡ 4 - r-m :01rL, _‘IBimiR-34a-3p miR-155-5p raiR-223-3p圖3-7兩種方法對(duì)miRNA基因定量的比較Fig. 3-7 The contrast of the two methods to quantify the genes of miRNA3.3 miRNAs重組質(zhì)粒的構(gòu)建收集小it的脊髓組織用于基因組DNA的提取，用各目的基因的特異性引物經(jīng)過PCR擴(kuò)增獲得miR-lOlc、miR-155和miR-223的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物片段，大小分別為447 bp、359bp和514bp，結(jié)果見圖3-8。將目的片段進(jìn)行膠回收后連接PMD-18T vector，并轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞，蹄選陽性克隆，菌液PCR結(jié)果見圖3-9,結(jié)果表明挑選的單克隆均能擴(kuò)增到與目的基因大小一致的基因片段。送測(cè)序分析正確后抽提質(zhì)粒，并用含Xhol和BamH I酶切位點(diǎn)的各目的基因的特異性引物進(jìn)行亞克隆。亞克隆質(zhì)粒通過測(cè)序分析正確后，用Xho I和BamH I限制性內(nèi)切酶分別雙酶切Y-miR-lOlc、Y-miR-lSS.39

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]廣西流行狂犬病毒糖蛋白基因的遺傳性分析[J]. 楊健,張紅普,章民,李曉寧,何曉霞,謝琳娟,陸專靈,韋顯凱,唐海波,羅廷榮.  南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2012(10)
[2]MicroRNA作用機(jī)制研究的新進(jìn)展[J]. 趙爽,劉默芳.  中國(guó)科學(xué)（C輯:生命科學(xué)）. 2009(01)
[3]廣西狂犬病病毒分子流行病學(xué)研究[J]. 莫兆軍,李浩,陶小燕,黃莉榮,周開姣,閉福銀,楊進(jìn)業(yè),唐青.  應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué). 2007(05)
[4]狂犬病毒生物學(xué)特征研究進(jìn)展[J]. 熊成龍,張永振,盧思奇.  中華流行病學(xué)雜志. 2006(10)



本文編號(hào)：3278950