本試驗(yàn)采用細(xì)胞培養(yǎng)術(shù)、RT-PCR技術(shù)、光鏡、電鏡、熒光定量RT-PCR、TUNEL和流式細(xì)胞術(shù)等多種研究方法,對(duì)近幾年來(lái)湖北省鴨源呼腸孤病毒分離株（Duck Reovirus, DRV） JZ061214株、HP080421株、HP081122株、HP09318株和YM101120株感染BHK-21細(xì)胞后細(xì)胞的病理變化特點(diǎn)、基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、病毒增殖狀況和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況等作了系統(tǒng)的研究。DRV感染BHK-21細(xì)胞的病理變化情況：攻毒后24h,細(xì)胞開始出現(xiàn)病變,表現(xiàn)為有的細(xì)胞圓縮,溶解、碎裂,攻毒48h后,病變逐漸加重,圓縮細(xì)胞越來(lái)越多,并可見懸浮的巨細(xì)胞,攻毒72h后,大量死亡細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中。細(xì)胞經(jīng)H.E染色,顯微鏡觀察可見：部分細(xì)胞死亡,感染細(xì)胞核固縮、碎裂,且出現(xiàn)嗜酸性包涵體和合胞體。感染DRV的BHK-21被收集用來(lái)制作超薄切片,電鏡下可觀察到大小不一的空泡,同時(shí),細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)晶格狀排列的病毒顆粒,病毒在細(xì)胞質(zhì)增殖、復(fù)制,通過細(xì)胞崩解釋放出來(lái)。DRV感染BHK-21后的增殖情況：于接種病毒后1-72h七個(gè)時(shí)間段分別進(jìn)行收毒,用熒光定量RT-PCR法檢測(cè)所獲病毒含量。結(jié)果表明,... 

【文章來(lái)源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：66 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
前言
    1 禽呼腸孤病毒(ARV)病概述
        1.1 呼腸孤病毒病
        1.2 流行病學(xué)
            1.2.1 傳染源
            1.2.2 傳播途徑
            1.2.3 易感動(dòng)物
        1.3 雞呼腸孤病毒感染
        1.4 鴨呼腸孤病毒感染
    2 禽呼腸孤病毒
        2.1 呼腸孤病毒的形態(tài)特點(diǎn)
        2.2 病毒對(duì)細(xì)胞的致病性
        2.3 病毒的基因組結(jié)構(gòu)
    3 呼腸孤病毒與細(xì)胞凋亡
本研究的目的與意義
材料與方法
    1 材料
        1.1 病毒
        1.2 細(xì)胞
        1.3 參考序列
        1.4 主要實(shí)驗(yàn)耗材
        1.5 主要儀器設(shè)備
        1.6 主要溶液及其配制
            1.6.1 細(xì)胞生長(zhǎng)(營(yíng)養(yǎng))液
            1.6.2 細(xì)胞維持液
            1.6.3 PBS(0.1M,pH=7.2,無(wú)鈣鎂)配制
            1.6.4 4%中性多聚甲醛
            1.6.5 50×TAE電泳緩沖液
            1.6.6 瓊脂糖凝膠
            1.6.7 TBS(0.01M,pH=7.5)配法
            1.6.8 2.5%戊二醛固定液配制
            1.6.9 LB配方
    2 方法
        2.1 BHK-21細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
        2.2 鴨源呼腸孤病毒的接種和增殖
        2.3 鴨源呼腸孤病毒致BHK-21細(xì)胞的病變
        2.4 TUNEL法染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡
        2.5 鴨源呼腸孤病毒致BHK-21細(xì)胞的超微病變及觀察
        2.6 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)DRV感染后BHK-21細(xì)胞和其培養(yǎng)液混合物中的病毒含量
        2.7 流式細(xì)胞儀對(duì)4株DRV攻毒后BHK-21細(xì)胞凋亡的檢測(cè)
        2.8 鴨源呼腸孤病毒S組基因的擴(kuò)增
        2.9 產(chǎn)物的回收和純化
        2.10 產(chǎn)物連接和轉(zhuǎn)化
        2.11 菌液PCR鑒定
        2.12 序列分析
    3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理
結(jié)果與分析
    1 病毒致BHK-21細(xì)胞的病理變化觀察
        1.1 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)
        1.2 光鏡下觀察細(xì)胞病變
        1.3 鴨源呼腸孤病毒致BHK-21細(xì)胞的超微病變
    2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)DRV感染后BHK-21細(xì)胞和其培養(yǎng)液混合物中的病毒含量
    3 BHK-21細(xì)胞感染DRV后,應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果
    4 BHK-21細(xì)胞感染DRV后,應(yīng)用TUNEL進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)的結(jié)果
    5 DRV S基因組的擴(kuò)增結(jié)果及序列分析
        5.1 DRV S基因組的擴(kuò)增
            5.1.1 S2基因的擴(kuò)增
            5.1.2 S3基因的擴(kuò)增
            5.1.3 S4基因的擴(kuò)增
        5.2 DRV S組基因序列分析
            5.2.1 DRV S2基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析結(jié)果
            5.2.2 DRV S3基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析結(jié)果
            5.2.3 DRV S4基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析結(jié)果
討論
    1 DRV致BHK-21細(xì)胞病變特點(diǎn)
    2 各株DRV細(xì)胞凋亡與病毒增殖特點(diǎn)
    3 DRV S組基因分析
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]新型鴨呼腸孤病毒的分離與鑒定[J]. 陳少鶯,陳仕龍,林鋒強(qiáng),王劭,江斌,程曉霞,朱小麗,李兆龍.  病毒學(xué)報(bào). 2012(03)
[2]番鴨呼腸孤病毒分子流行病學(xué)研究[J]. 林鋒強(qiáng),朱小麗,陳少鶯,王劭,陳仕龍,程曉霞,江斌,李兆龍.  福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2012(03)
[3]番鴨呼腸孤病毒YB株σNS基因的克隆和序列分析[J]. 吳異健,王劭,黃一帆,吳寶成.  江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2011(01)
[4]鴨源呼腸孤病毒感染引起雛鴨免疫損傷的觀察[J]. 李爽,谷長(zhǎng)勤,白家媛,張紅,張萬(wàn)坡,程國(guó)富,胡薛英.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2010(21)
[5]兩株草魚呼腸孤病毒江西株的分離與鑒定[J]. 徐洋,郝貴杰,沈錦玉,鄭善堅(jiān),潘曉藝,姚嘉赟,尹文林.  淡水漁業(yè). 2010(03)
[6]番鴨呼腸孤病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡觀察[J]. 祁保民,陳曉燕,吳寶成,姚金水,張紅雷.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2010(04)
[7]新型鴨呼腸孤病毒分離株的致病性研究[J]. 陳仕龍,陳少鶯,程曉霞,林鋒強(qiáng),江斌,王劭,朱小麗,張世忠,李兆龍.  西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2010(04)
[8]蝙蝠呼腸孤病毒感染BHK-21和Vero-E6細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的比較觀察[J]. 孟軻音,杜林峰,涂長(zhǎng)春,段銘,鄒嘯環(huán).  中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2010(02)
[9]我國(guó)鴨呼腸孤病毒感染相關(guān)的疫病[J]. 黃瑜,蘇敬良,施少華,傅光華,程龍飛,林芳,林建生,陳紅梅.  中國(guó)獸醫(yī)雜志. 2009(07)
[10]流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)石見穿多糖誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡率[J]. 鄭海音,武一曼,林信富,陳素娟.  福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào). 2009(03)

碩士論文
[1]3株鴨源呼腸孤病毒對(duì)鴨胚成纖維細(xì)胞致病性研究[D]. 余愛花.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[2]鴨源呼腸孤病毒熒光定量RT-PCR方法的建立與應(yīng)用[D]. 楊旭.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[3]鴨源禽呼腸孤病毒感染雛鴨的免疫病理學(xué)研究[D]. 李爽.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[4]鴨源呼腸孤病毒的分離與鑒定[D]. 張寶來(lái).華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009
[5]禽呼腸孤病毒S3、S4基因的克隆與序列分析[D]. 李建云.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
[6]番鴨呼腸孤病毒感染番鴨的組織學(xué)病變及細(xì)胞凋亡研究[D]. 陳曉燕.福建農(nóng)林大學(xué) 2007



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