為了建立簡便、快速的FADV-4環(huán)介導等溫擴增（LAMP）可視化檢測方法,試驗以FADV-4高度保守的基因序列hexon基因為靶基因設(shè)計了6條引物,對反應體系的Mg²⁺濃度、Bst DNA聚合酶用量、反應溫度、反應持續(xù)時間進行優(yōu)化,考察了優(yōu)化體系的靈敏度及特異性。同時用建立的FADV-4 LAMP及LAMP-HNB可視化的檢測方法對臨床模擬樣品進行檢測。結(jié)果表明:當Mg²⁺濃度為6 mmol/L、Bst DNA聚合酶濃度為320 U/mL、反應溫度為65℃、反應時間為60 min、HNB使用濃度為120μmol/L時反應最優(yōu)。LAMP最低DNA檢測濃度為1.46 pg/μL,靈敏度是PCR的100倍,臨床模擬樣品LAMP、LAMP-HNB檢測結(jié)果與普通PCR檢測結(jié)果完全符合。說明所建立的FADV-4 LAMP-HNB可視化檢測方法適用于臨床的快速診斷。 

【文章來源】：黑龍江畜牧獸醫(yī). 2020,(24)北大核心

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

Mg2+濃度優(yōu)化試驗結(jié)果

不同濃度Bst DNA聚合酶反應時均顯示有特異條帶,且條帶在40～320 U/mL范圍內(nèi)明顯增強,但是Bst DNA聚合酶濃度為320,390 U/mL時對應的條帶亮度基本一致(見圖2)。為了節(jié)約試劑減少成本,因此選擇Bst DNA聚合酶最佳濃度為320 U/mL。3.3 反應溫度的優(yōu)化

LAMP反應溫度設(shè)置從60,61,62,63,64,65,66,67 ℃依次遞增,反應溫度為64,65,66,67 ℃時有明顯拖尾的梯形條帶,64 ℃時梯形條帶較淡,65,66,67 ℃時條帶亮度基本一致,60,61,62,63 ℃梯形條帶不明顯(見圖3)。因此,最終選擇65 ℃為最佳反應溫度。3.4 反應時間的優(yōu)化

【參考文獻】：
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