雞傳染性支氣管炎（avian infectious bronchitis, IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（avian infectious bronchitis virus, IBV）引起的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病。由于IBV變異頻繁,血清型復(fù)雜,所致疾病的臨床表現(xiàn)差異較大,在不同地區(qū)和不同時(shí)間的地方流行毒株總是以各種形式出現(xiàn),所以對(duì)于IBV的分子生物學(xué)研究和與病毒入侵相關(guān)受體的研究成為一個(gè)重點(diǎn)。IBV纖突糖蛋白（Spike, S）是位于病毒粒子表面的結(jié)構(gòu)蛋白,它既有介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生病毒中和抗體的抗原表位,具有良好的免疫原性,又含有介導(dǎo)病毒侵入宿主細(xì)胞的受體結(jié)合域,是冠狀病毒入侵和繁殖的關(guān)鍵蛋白。1.本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了編碼IBV Beaudette株S1基因的pET-S1原核重組表達(dá)質(zhì)粒,并在E.Coli Rosetta中進(jìn)行了原核表達(dá),獲得了大小為63 Ku的目的條帶,使用IBV全病毒多抗進(jìn)行Western blot證實(shí)所表達(dá)的蛋白為IBV S1蛋白。2.利用噬菌體隨機(jī)十二肽庫,以IBV S1重組蛋白為靶分子,進(jìn)行了四輪生物淘選。對(duì)第四輪洗脫物進(jìn)行功能鑒定,淘選出10個(gè)噬菌體單克... 

【文章來源】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：129 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
1 引言
    1.1 冠狀病毒基因組結(jié)構(gòu)和相關(guān)蛋白研究進(jìn)展
        1.1.1 冠狀病毒的分類
        1.1.2 冠狀病毒基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
        1.1.3 冠狀病毒基因組功能
        1.1.4 冠狀病毒相關(guān)受體結(jié)構(gòu)和功能
    1.2 雞傳染性支氣管炎研究進(jìn)展
        1.2.1 雞傳染性支氣管炎的流行病學(xué)
        1.2.2 雞傳染性支氣管炎的臨床癥狀和病理機(jī)制
        1.2.3 雞傳染性支氣管炎的診治
    1.3 噬菌體展示技術(shù)的研究進(jìn)展
        1.3.1 噬菌體展示技術(shù)概述
        1.3.2 模擬病毒蛋白表位
        1.3.3 病毒作用機(jī)制的研究
        1.3.4 在新型疫苗研制方面的應(yīng)用
    1.4 研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 菌種、載體及質(zhì)粒
        2.1.3 工具酶、試劑盒和抗體試劑
        2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)參照物
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)試劑的配制
        2.1.6 儀器設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 IBV S1基因的克隆及原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.2 IBV S1基因的原核表達(dá)及鑒定
        2.2.3 噬菌體隨機(jī)十二肽庫對(duì)S1重組蛋白親和配體的生物淘選
        2.2.4 噬菌體結(jié)合克隆的特征鑒定、序列測(cè)定及多肽合成
        2.2.5 S1蛋白親和多肽的體外抗病毒活性檢測(cè)
        2.2.6 熒光標(biāo)記S1蛋白親和多肽對(duì)IBV感染雛雞組織內(nèi)病毒的檢測(cè)
        2.2.7 IBV檢測(cè)方法的建立
        2.2.8 gAPN基因的克隆及原核表達(dá)
        2.2.9 gAPN重組蛋白的純化、多抗制備及活性鑒定
        2.2.10 gAPN真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染
        2.2.11 S1蛋白與gAPN蛋白的親和鑒定
        2.2.12 gAPN多克隆抗體對(duì)IBV感染CEK細(xì)胞的阻斷
        2.2.13 gAPN介導(dǎo)IBV感染Hela細(xì)胞
        2.2.14 gAPN的生物信息學(xué)分析
3 結(jié)果
    3.1 IBV S1基因的克隆及原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.1.1 IBV S1基因的RT-PCR擴(kuò)增
        3.1.2 S1基因重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
    3.2. S1重組蛋白的表達(dá)及鑒定
        3.2.1 S1重組蛋白的表達(dá)
        3.2.2 S1重組蛋白的Western blot鑒定
    3.3 噬菌體十二肽庫對(duì)S1重組蛋白親和配體的生物淘選
        3.3.1 S1重組蛋白的純化
        3.3.2 噬菌體十二肽庫對(duì)靶分子的四輪淘洗
        3.3.3 S1蛋白親和多肽的抗病毒活性檢測(cè)
        3.3.4 熒光標(biāo)記S1蛋白親和多肽對(duì)IBV感染雛雞組織內(nèi)病毒的檢測(cè)
        3.3.5 IBV檢測(cè)方法的建立
    3.4 gAPN的原核表達(dá)、多抗制備及生物學(xué)功能的研究
        3.4.1 gAPN基因的克隆
        3.4.2 gAPN基因的原核表達(dá)
        3.4.3 gAPN多克隆血清制備及生物學(xué)功能的測(cè)定
    3.5 gAPN真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        3.5.1 gAPN真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.5.2 gAPN真核表達(dá)質(zhì)粒的的轉(zhuǎn)染
    3.6 S1蛋白與gAPN蛋白的親和鑒定
        3.6.1 S1蛋白親和噬菌體與gAPN蛋白的競(jìng)爭(zhēng)ELISA
        3.6.2 S1蛋白親和噬菌體與gAPN多抗的間接ELISA
        3.6.3 原核表達(dá)gAPN蛋白與IBV的Western blot鑒定
        3.6.4 IBV S1蛋白和gAPN蛋白的免疫共沉淀
    3.7 gAPN多克隆抗體阻斷IBV感染CKE細(xì)胞
        3.7.1 gAPN多抗阻斷IBV感染CEK細(xì)胞的Real-time PCR檢測(cè)
        3.7.2 gAPN多克隆抗體阻斷IBV感染CEK細(xì)胞的病變觀察
    3.8 gAPN受體功能位點(diǎn)的鑒定
        3.8.1 gAPN轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞對(duì)IBV感染的影響
        3.8.2 IBV和gAPN在BHK細(xì)胞的間接免疫熒光共定位檢測(cè)
        3.8.3 gAPN表達(dá)量對(duì)IBV感染Hela細(xì)胞的影響
        3.8.4 gAPN對(duì)不同IBV毒株感染Hela細(xì)胞的影響
        3.8.5 不同長度gAPN對(duì)IBV感染Hela的影響
    3.9 gAPN的生物信息學(xué)分析
4 討論
    4.1 IBV S1蛋白的生物學(xué)功能
    4.2 S1蛋白親和肽的篩選及序列測(cè)定
    4.3 IBV檢測(cè)方法的建立
    4.4 S1蛋白特異性標(biāo)記多肽對(duì)IBV抗原分布研究
    4.5 gAPN作為IBV感染細(xì)胞功能受體的鑒定
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]布魯氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)方法的建立和臨床應(yīng)用的初步研究[D]. 曾慶賀.吉林大學(xué) 2014
[2]IBV山西分離株人工感染雛雞的臨床病理學(xué)研究及病毒在體內(nèi)分布的檢測(cè)[D]. 楊麗媛.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[3]雞腎型IBV陜西分離株的分子遺傳變異分析及感染雛雞的病理組織學(xué)觀察[D]. 楊濤.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2013
[4]雞傳染性支氣管炎病毒抗原表位的篩選及鑒定[D]. 安燁.首都師范大學(xué) 2007
[5]雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）H52毒株病毒中和多肽的體外鑒定及S基因的克隆[D]. 彭博.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2005



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