表達異源優(yōu)勢抗原的轉基因球蟲激發(fā)宿主保護性免疫應答的研究
發(fā)布時間：2021-06-30 07:52
疫苗免疫是動物疫病防控最主要策略之一。在動物疫病疫苗研制中,抗原運送載體在抗原發(fā)掘以及提升疫苗安全性和有效性中具有重要作用。隨著艾美耳屬球蟲反向遺傳操作平臺及其激發(fā)宿主免疫應答檢測系統(tǒng)的建立與不斷完善,轉基因艾美耳屬球蟲作為疫苗載體具備了可行性。本研究從抗原因素（主要是抗原的空間位置、表達量、持續(xù)時間/方式）和宿主因素（免疫受體-配體和細胞因子）進行優(yōu)化,進而提升表達異源抗原的轉基因球蟲激發(fā)的免疫保護力,從而為推進艾美耳屬球蟲作為疫苗載體提供數(shù)據(jù)支撐。為了研究病原抗原的表達量對轉基因球蟲激發(fā)宿主免疫應答的影響,本研究以增強型黃色熒光蛋白（EYFP）和禽流感病毒M2e抗原為模型,通過調控異源抗原表達的不同元件、P2A介導的單表達框共表達多抗原以及異源抗原多拷貝串聯(lián)表達等多種策略增強轉基因球蟲表達異源抗原的量。結果顯示,SAG13強啟動子顯著增強EYFP的表達水平;艾美耳屬球蟲可高效利用P2A的自我剪切功能實現(xiàn)多異源蛋白的共表達;多拷貝串聯(lián)的M2e的表達水平顯著高于單拷貝表達。進一步地,提升轉基因球蟲表達異源抗原（EYFP或M2e）的量,其激發(fā)宿主產(chǎn)生特異性免疫應答的水平顯著提升。結果表明...
【文章來源】：中國農業(yè)大學北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：122 頁
【學位級別】：博士
【部分圖文】：
圖２．?３?２Ａ多肽成功剪切ＥｔＥＲ表達的ＥＹＦＰ和ＲＦＰ??Ａ．?ＥＹＦＰ主要表達于細胞核，ＲＦＰ在胞漿中有表達（ａ－ｆ）
前期研究結果證實啟動子的強弱是影響轉基因球蟲表達異源蛋白水平的關鍵因素。為了分析??和量化強弱啟動子調控蛋白表達水平的差異，建立轉基因球蟲表達異源蛋白量的檢測平臺。本研??宄選�。樱粒牵保澈停龋椋螅磫幼诱{控模式蛋白ＥＹＦＰ表達的穩(wěn)定轉基因球蟲株ＥｔＥＲ?（圖２．２和圖??２．３）和ＥｔＭ２ｅ［２９，５４］為強、弱啟動子作用元件的模式蟲株分析ＥＹＦＰ的表達水平。在相同觀察模式??（激光共聚焦顯微鏡各調節(jié)參數(shù)均保持一致）下，ＥｔＭ２ｅ蟲株ＥＹＦＰ的熒光強度顯著低于ＥｔＥＲ??蟲株的熒光強度，前者的平均灰度值僅是后者的１／８?（圖２．４?Ａ）。本研究還以ＥＹＦＰ為模式抗原測??定其在轉基因球蟲可溶性抗原的相對含量進而建立檢測轉基因球蟲表達異源蛋白水平的平臺。以??重組ＥＹＦＰ為標準品，ＥＹＦＰ特異性抗體進行免疫印跡，得到目的條帶的積分光密度值（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ??Ｏｐｔｉｃａｌ?Ｄｅｎｓｉｔｙ，?ＩＯＤ）與蛋白濃度之間的線性關系（圖２．４Ｂ）。同等條件下，相同濃度（５００?ｎｇ／ｐ）??的ＥｔＭ２ｅ和ＥｔＥＲ可溶性抗原檢測到的丨ＯＤ值分別為７８８．４２和２１２７．４，經(jīng)公式（圖２．４?Ｂ）推算??出ＥｔＭ２ｅ和ＥｔＥＲ可溶性抗原中ＥＹＦＰ的濃度為１．５８?ｎｇ化丨和４．４６?ｎｇ／ｊｉｌ。所以ＥＹＦＰ占ＥｔＭ２ｅ和??ＥｔＥＲ可溶性抗原的比例分別為３．１６９６〇和８．９２％〇。綜上
轉基因球蟲表達異源蛋白水平的有效策略。本研宄進一步分析髙表達模式抗原ＥＹＦＰ和Ｍ２ｅ的??轉基因球蟲激發(fā)異源抗原特異性免疫應答的強度。ＥＹＦＰ不同表達水平的轉基因球蟲（ＥｔＥＲ和??ＥｔＭ２ｅ）經(jīng)口免疫雞群（圖２．６Ａ），于免疫前和免疫后的不同時間點采集血清測定ＥＹＦＰ、ＳＡＧ１３??和球蟲全抗原（ＥｔＡｇ）特異性的抗體應答水平。研宄結果顯示，二免后ＥＹＦＰ、ＳＡＧＩ３和ＥｔＡｇ的??抗體水平均顯著提升，其中ＥｔＥＲ免疫組ＥＹＦＰ抗體水平顯著髙于ＥｔＭ２ｅ免疫組，野生型球蟲??（ＷＴ）免疫組和對照組不產(chǎn)生ＥＹＦＰ特異性的抗體應答；內源性抗原ＳＡＧ１３和ＥｔＡｇ特異性的??抗體應答無論是轉基因球蟲還是野生型球蟲免疫后均顯著提升（圖２．６Ｂ）。研宄結果說明，提升??轉基因球蟲表達ＥＹＦＰ的量可顯著增強其激發(fā)宿主免疫應答的水平。??Ｍ２ｅ不同拷貝數(shù)的轉基因球蟲（１２拷貝ＥｔｐＭ２ｅ和單拷貝ＥｔＭ２ｅ）經(jīng)口免疫雞群（圖２．７Ａ），??分析免疫后的卵囊排出和Ｍ２ｅ特異性抗體的水平。結果顯示，各球蟲免疫組二次免疫后的卵囊排??出顯著低于初次免疫后的卵囊排出（圖２．７?Ｂ），說明多拷貝高表達異源病毒抗原對球蟲的免疫原??性沒有影響。經(jīng)加強免疫后
【參考文獻】：
期刊論文
[1]禽流感-火雞皰疹病毒重組活載體疫苗的研究進展[J]. 郝小利,劉秀梵. 中國家禽. 2015(21)
[2]Salmonella Typhi:from a Human Pathogen to a Vaccine Vector[J]. Victor Tunje Jeza. Cellular & Molecular Immunology. 2008(02)
[3]痘病毒疫苗載體[J]. 龐樂君,刁天喜. 國外醫(yī)學(藥學分冊). 2004(03)
博士論文
[1]融合表達IgY/IgG Fc片段和H9N2禽流感病毒HA1轉基因艾美耳球蟲的構建及免疫原性研究[D]. 秦梅.中國農業(yè)大學 2015
本文編號：3257354
【文章來源】：中國農業(yè)大學北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：122 頁
【學位級別】：博士
【部分圖文】：
圖２．?３?２Ａ多肽成功剪切ＥｔＥＲ表達的ＥＹＦＰ和ＲＦＰ??Ａ．?ＥＹＦＰ主要表達于細胞核，ＲＦＰ在胞漿中有表達（ａ－ｆ）
前期研究結果證實啟動子的強弱是影響轉基因球蟲表達異源蛋白水平的關鍵因素。為了分析??和量化強弱啟動子調控蛋白表達水平的差異，建立轉基因球蟲表達異源蛋白量的檢測平臺。本研??宄選�。樱粒牵保澈停龋椋螅磫幼诱{控模式蛋白ＥＹＦＰ表達的穩(wěn)定轉基因球蟲株ＥｔＥＲ?（圖２．２和圖??２．３）和ＥｔＭ２ｅ［２９，５４］為強、弱啟動子作用元件的模式蟲株分析ＥＹＦＰ的表達水平。在相同觀察模式??（激光共聚焦顯微鏡各調節(jié)參數(shù)均保持一致）下，ＥｔＭ２ｅ蟲株ＥＹＦＰ的熒光強度顯著低于ＥｔＥＲ??蟲株的熒光強度，前者的平均灰度值僅是后者的１／８?（圖２．４?Ａ）。本研究還以ＥＹＦＰ為模式抗原測??定其在轉基因球蟲可溶性抗原的相對含量進而建立檢測轉基因球蟲表達異源蛋白水平的平臺。以??重組ＥＹＦＰ為標準品，ＥＹＦＰ特異性抗體進行免疫印跡，得到目的條帶的積分光密度值（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ??Ｏｐｔｉｃａｌ?Ｄｅｎｓｉｔｙ，?ＩＯＤ）與蛋白濃度之間的線性關系（圖２．４Ｂ）。同等條件下，相同濃度（５００?ｎｇ／ｐ）??的ＥｔＭ２ｅ和ＥｔＥＲ可溶性抗原檢測到的丨ＯＤ值分別為７８８．４２和２１２７．４，經(jīng)公式（圖２．４?Ｂ）推算??出ＥｔＭ２ｅ和ＥｔＥＲ可溶性抗原中ＥＹＦＰ的濃度為１．５８?ｎｇ化丨和４．４６?ｎｇ／ｊｉｌ。所以ＥＹＦＰ占ＥｔＭ２ｅ和??ＥｔＥＲ可溶性抗原的比例分別為３．１６９６〇和８．９２％〇。綜上
轉基因球蟲表達異源蛋白水平的有效策略。本研宄進一步分析髙表達模式抗原ＥＹＦＰ和Ｍ２ｅ的??轉基因球蟲激發(fā)異源抗原特異性免疫應答的強度。ＥＹＦＰ不同表達水平的轉基因球蟲（ＥｔＥＲ和??ＥｔＭ２ｅ）經(jīng)口免疫雞群（圖２．６Ａ），于免疫前和免疫后的不同時間點采集血清測定ＥＹＦＰ、ＳＡＧ１３??和球蟲全抗原（ＥｔＡｇ）特異性的抗體應答水平。研宄結果顯示，二免后ＥＹＦＰ、ＳＡＧＩ３和ＥｔＡｇ的??抗體水平均顯著提升，其中ＥｔＥＲ免疫組ＥＹＦＰ抗體水平顯著髙于ＥｔＭ２ｅ免疫組，野生型球蟲??（ＷＴ）免疫組和對照組不產(chǎn)生ＥＹＦＰ特異性的抗體應答；內源性抗原ＳＡＧ１３和ＥｔＡｇ特異性的??抗體應答無論是轉基因球蟲還是野生型球蟲免疫后均顯著提升（圖２．６Ｂ）。研宄結果說明，提升??轉基因球蟲表達ＥＹＦＰ的量可顯著增強其激發(fā)宿主免疫應答的水平。??Ｍ２ｅ不同拷貝數(shù)的轉基因球蟲（１２拷貝ＥｔｐＭ２ｅ和單拷貝ＥｔＭ２ｅ）經(jīng)口免疫雞群（圖２．７Ａ），??分析免疫后的卵囊排出和Ｍ２ｅ特異性抗體的水平。結果顯示，各球蟲免疫組二次免疫后的卵囊排??出顯著低于初次免疫后的卵囊排出（圖２．７?Ｂ），說明多拷貝高表達異源病毒抗原對球蟲的免疫原??性沒有影響。經(jīng)加強免疫后
【參考文獻】：
期刊論文
[1]禽流感-火雞皰疹病毒重組活載體疫苗的研究進展[J]. 郝小利,劉秀梵. 中國家禽. 2015(21)
[2]Salmonella Typhi:from a Human Pathogen to a Vaccine Vector[J]. Victor Tunje Jeza. Cellular & Molecular Immunology. 2008(02)
[3]痘病毒疫苗載體[J]. 龐樂君,刁天喜. 國外醫(yī)學(藥學分冊). 2004(03)
博士論文
[1]融合表達IgY/IgG Fc片段和H9N2禽流感病毒HA1轉基因艾美耳球蟲的構建及免疫原性研究[D]. 秦梅.中國農業(yè)大學 2015
本文編號：3257354
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