為開發(fā)高效表面展示副結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis,MAP）抗原的大腸桿菌活載體疫苗,本研究將融合的目的基因map0862-2154c克隆于pET-INP載體,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-INP-6254c。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)western blot及流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)檢測目的蛋白的表達(dá)及定位,western blot分析結(jié)果顯示,誘導(dǎo)的全菌以及超聲后的上清和沉淀在75 ku處均出現(xiàn)目的條帶;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,重組蛋白rMAP62-54c能夠表達(dá)并展示到細(xì)胞表面。將110只BABL/c小鼠分為4組:INP-28a/BL21對照組（n=30）和INP-rMAP62-54c/BL21疫苗組（n=30）（均以5×10⁵cfu/只腹腔注射免疫小鼠3次）,PBS對照組（n=30）（注射等體積PBS）,三免后以5×10⁵cfu/只MAP標(biāo)準(zhǔn)株K-10感染上述3組小鼠;空白組（n=20）（不做處理）。然后通過ELISA、流式細(xì)胞術(shù)等方法定期檢測各... 

【文章來源】：中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020,42(10)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

p ET-INP-6254c質(zhì)粒的雙酶切鑒定

將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行western blot分析，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)的全菌以及超聲后的上清和沉淀在75 ku處均出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期一致（圖2）。表明重組蛋白INP-r MAP62-54c已正確表達(dá)，并且部分以可溶形式存在。2.3 流式細(xì)胞儀表面展示鑒定結(jié)果

以空菌BL21為本底對照，將誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌體收集并固定，經(jīng)抗體孵育后的菌體利用流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果顯示，本底對照BL21陽性率為3.94%，而重組菌INP-r MAP62-54c/BL21陽性率為35.4%，因此約有31%的菌體表面展示出重組蛋白（圖3）。表明目的蛋白在細(xì)胞表面展示效率相對較高。2.4 小鼠血清Ig G抗體水平的檢測結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]牛副結(jié)核分枝桿菌多組分亞單位疫苗的初步研究[J]. 程玉笛,黨光輝,李鶴,李哲,劉虹秀,宋寧寧,劉思國.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2018(10)
[3]結(jié)核分枝桿菌抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868的克隆表達(dá)及血清診斷學(xué)初步評價[J]. 夏遠(yuǎn)志,王雪枝,劉海燦,李馬超,趙秀芹,樓永良,呂建新,萬康林.  疾病監(jiān)測. 2016(04)
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