發(fā)布時間：2021-06-27 06:01

　　本試驗通過體外分離培養(yǎng)馬骨骼肌衛(wèi)星細胞、鑒定以及氧化應(yīng)激調(diào)控機理的研究,建立了馬骨骼肌衛(wèi)星細胞的培養(yǎng)體系以及氧化應(yīng)激模型,闡明氧化應(yīng)激的調(diào)控機理,為運動馬的骨骼肌氧化應(yīng)激調(diào)控提供科學依據(jù)和研究基礎(chǔ)。本試驗主要分為以下三個部分,試驗一體外分離培養(yǎng)蒙古馬骨骼肌衛(wèi)星細胞并對獲得的細胞進行鑒定。試驗二選取可正常增值,生長狀況良好的骨骼肌衛(wèi)星細胞作為材料,利用H2O2來誘導骨骼肌衛(wèi)星細胞產(chǎn)生氧化損傷,研究不同濃度的H2O2對骨骼肌衛(wèi)星細胞的損傷情況,建立起骨骼肌衛(wèi)星細胞的氧化損傷模型,并篩選出H2O2最佳誘導劑量和作用時間。試驗三在建立骨骼肌衛(wèi)星細胞的正常對照模型和氧化損傷模型的基礎(chǔ)上,設(shè)計與Nrf2-ARE信號通路相關(guān)的基因引物,通過基因的相對表達量以及下游調(diào)控的抗氧化基因的表達情況,進而確定Nrf2-ARE信號通路調(diào)控蒙古馬骨骼肌衛(wèi)星細胞氧化損傷的機理。本研究得出以下結(jié)果:1.試驗一:馬骨骼肌衛(wèi)星細胞培養(yǎng)及鑒定選取健康的2歲蒙古馬,通過利用膠原酶和含0.25%EDTA的胰酶,兩步酶消化法獲得骨骼肌衛(wèi)星細胞,將分離得到的細胞經(jīng)細胞篩過濾去除直徑偏大的雜細胞和細胞碎片,并利用差速貼壁法純化肌衛(wèi)星... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２原代培養(yǎng)的骨骼肌衛(wèi)星細胞??Ｆｉｇ．２?Ｐｒｉｍａｒｙ?ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ｓｋｅｌｅｔａｌ?ｍｕｓｃｌｅ?ｓａｔｅｌｌｉｔｅ?ｃｅｌｌ??Ａ：１衛(wèi)Ｂ：３衛(wèi)Ｃ：５

￡?Ｎｒｆ２－ＡＲＥ信號通路介導的馬骨骼肌衛(wèi)星細胞氧化應(yīng)激的調(diào)控機理???３．１．２明膠對于骨骼肌衛(wèi)星細胞貼壁速度的影響??醪麗Ｐ：爾??Ｄ?Ｅ?覆＃篆幾＿邊餐輕｜參驗??圖３明膠優(yōu)化肌衛(wèi)星細胞貼壁速度??Ｆｉｇ．３?Ｇｅｌａｔｉｎ?ｏｐｔｉｍｉｚｅｓ?ｍｕｓｃｌｅ?ｓａｔｅｌｌｉｔｅ?ｃｅｌｌ?ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ?ｓｐｅｅｄ??Ａ：無明膠骨骼肌衛(wèi)星細胞貼壁ｌｈ；?Ｂ：無明膠骨骼肌衛(wèi)星細胞４ｈ；?Ｃ：無明膠??骨骼肌衛(wèi)星細胞８ｈ；?Ｄ：明膠鋪層骨骼肌衛(wèi)星細胞貼壁ｌｈ；?Ｅ：明膠鋪層骨骼肌??衛(wèi)星細胞貼壁４ｈ；?Ｆ：明膠鋪層骨骼肌衛(wèi)星細胞貼壁８ｈ。??ＳＣｓ的貼壁時間較長，貼壁速度緩慢，因此我們通過利用明膠鋪層來縮短其??的貼壁時間，以此優(yōu)化獲得蒙古馬ＳＣｓ的速度。根據(jù)對比有無明膠鋪層的細胞??貼壁情況（圖６），我們可以發(fā)現(xiàn)，無明膠組的細胞在培養(yǎng)ｌｈ后無細胞貼壁（圖??Ａ），細胞均漂浮在培養(yǎng)液表面。而有明膠組，大部分細胞同樣是漂浮狀態(tài)，但??是有個別細胞己經(jīng)開始貼壁（圖Ｄ），４ｈ后無明膠組的少量細胞開始貼壁（圖Ｂ），??而鋪有明膠組細胞貼壁數(shù)量更多且貼壁細胞的體積也大于無明膠貼壁組（圖Ｅ）。??８ｈ后無明膠組細胞貼壁數(shù)量增多，貼壁細胞體積變大（圖Ｃ），但是有明膠組??細胞己經(jīng)開始貼壁生長，并且已經(jīng)開始延伸，細胞形態(tài)也開始發(fā)生變化（圖Ｆ）。??以上結(jié)果表明，有明膠鋪層可以增加細胞的貼壁速度，減少細胞的貼壁時間。??３．１．３誘導分化法鑒定骨骼肌衛(wèi)星細胞??

?內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文?２３??ＩＨＩ?ＨＨ??圖４未分化與分化的肌衛(wèi)星細胞??Ｆｉｇ．４?Ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ?ａｎｄ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ?ｍｕｓｃｌｅ?ｓａｔｅｌｌｉｔｅ?ｃｅｌｌｓ??Ａ：分化前達到８０％匯合的肌衛(wèi)星細胞；Ｂ：分化后產(chǎn)生肌管??ＳＣｓ具有可分化為肌管的特點，我們利用ＳＣｓ的這一特點對所分離出的細胞??進行鑒定（圖２），通過對正常增殖生長并且匯合率達到７０％－８０％時的ＳＣｓ?（圖??Ａ），棄掉皿中的原培養(yǎng)液，清洗一遍后，更換含有２％馬血清的的分化培養(yǎng)液??進行誘導分化，通過顯微鏡觀察細胞的形態(tài)變化，當更換分化培養(yǎng)液誘導分化后，??ＳＣｓ呈規(guī)律性的平行排列，細胞逐漸伸長、變細，增殖的細胞之間發(fā)生融合，并??可以觀察到肌管的形成（圖Ｂ）。對體外培養(yǎng)的牛ＳＣｓ進行誘導分化后發(fā)現(xiàn)細胞??進入分化狀態(tài)，ＳＣｓ融合形成多核肌管，在分化培養(yǎng)的第四天后，細胞形成大量??肌管，并排列成束ｗ］。Ｄｏｄｓｏｎ［６４］在ＤＭＥＭ－１％ＨＳ中培養(yǎng)４天可在體外誘導牛衛(wèi)??星細胞的最佳分化。研究結(jié)果同樣表明在培養(yǎng)初期觀察到的圓形細胞??正在増殖成肌細胞，而在第５天則觀察到多核肌管的形成。這些研宄結(jié)果可以證??明分化形成肌管是是ＳＣｓ的一個特點之一，同樣證明我們分離出來的骨骼肌衛(wèi)??星細胞具有良好的體外分化能力。??３．１．４差速貼壁法鑒定馬骨骼肌衛(wèi)星細胞??

【參考文獻】：
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本文編號：3252286