豬偽狂犬�。≒esudorabies virus,PRV）是二類動物疫病,在我國大面積流行,目前主要是用Bartha K61株相關疫苗進行預防免疫。但越來越多的報道指出該疫苗免疫豬場出現PRV發(fā)病或豬血清轉陽的情況。為解決當前疫情,研發(fā)基于本土變異毒株的PRV基因缺失疫苗,進而控制PRV感染態(tài)勢是當前的主要策略。本試驗首先通過改造Puc57質粒,加入TK基因上下游同源臂和紅色熒光表達盒,成功構建了可表達紅色熒光的含有TK同源臂的Puc57-TK-RED轉移載體。隨后將實驗室已構建的PRV XJ gE/gI雙基因缺失株病毒基因組DNA和轉移載體質粒DNA共轉染細胞,通過同源重組的方法缺失部分TK基因。依靠紅色熒光標簽,通過空斑實驗重復篩選和純化缺失病毒株。純化后傳代20代,通過特異性gE,gB,TK基因PCR檢測純化病毒株,并結合熒光倒置顯微鏡下觀察的缺失病毒株細胞病變結果,綜合判定本次試驗成功構建了一株帶有綠色熒光和紅色熒光標簽的PRV XJ gI/gE/TK三基因缺失病毒株。PRV XJ gI/gE/TK三基因缺失株傳代穩(wěn)定性鑒定結果表明,缺失株傳代過程穩(wěn)定,沒有外源病毒污染,不會因... 

【文章來源】：四川農業(yè)大學四川省 211工程院校

【文章頁數】：72 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

Puc57質粒圖譜

2.3.4 TransIT-X2 Dynamic Delivery System 共轉染細胞及同源重組使用核酸蛋白儀測定獲得的Puc57-TK-RED質粒和PRV XJ gE/gI雙基因缺失株總 DNA 的濃度及純度。使用 TransIT-X2 Dynamic Delivery System 脂質體轉染試劑盒進行 PRV-XJ gE/gI 雙基因缺失株 DNA 和 PUC57-TK-RED 質粒DNA 共轉染 293T 細胞，具體操作步驟及流程如圖 2-2。調節(jié)各試劑劑量以不斷優(yōu)化共轉染效果，通過同源重組的方式完成 PRV-XJ gE/gI 雙基因缺失株 TK基因的缺失，缺失示意圖如圖 2-3。

圖 2-3 缺失構建示意圖Fig.2-3 Missing sketch map2.3.5 PRV XJ gI/gE/ TK 三基因缺失株的篩選及純化對共轉染后的細胞進行觀察，通過熒光標記篩選缺失成功細胞并進一步純化，操作步驟如下：1）待共轉染的細胞出現病變，并在熒光倒置顯微鏡下同時發(fā)現熒光時，收集該孔細胞液，并進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)后收集病毒液。2）將病毒液梯度稀釋至 10-3-10-7，接種于 12 孔板的 BHK21 細胞，每個稀釋梯度接種 2 孔，每孔接種 500μl，每隔 20min 來回搖晃細胞板，4~6h 后棄上清液，并且 PBS 清洗 2~3 次。3）將預熱至 42℃的 1.5％無菌低熔點瓊脂糖與 2×DMEM 按 1：1 混合，將混合后的營養(yǎng)液鋪至每個孔中，置于 4℃靜置 20~30min，凝固后置于 37℃、5％CO2

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號：3240450