豬偽狂犬�。≒esudorabies virus,PRV）是二類動物疫病,在我國大面積流行,目前主要是用Bartha K61株相關(guān)疫苗進(jìn)行預(yù)防免疫。但越來越多的報(bào)道指出該疫苗免疫豬場出現(xiàn)PRV發(fā)病或豬血清轉(zhuǎn)陽的情況。為解決當(dāng)前疫情,研發(fā)基于本土變異毒株的PRV基因缺失疫苗,進(jìn)而控制PRV感染態(tài)勢是當(dāng)前的主要策略。本試驗(yàn)首先通過改造Puc57質(zhì)粒,加入TK基因上下游同源臂和紅色熒光表達(dá)盒,成功構(gòu)建了可表達(dá)紅色熒光的含有TK同源臂的Puc57-TK-RED轉(zhuǎn)移載體。隨后將實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的PRV XJ gE/gI雙基因缺失株病毒基因組DNA和轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,通過同源重組的方法缺失部分TK基因。依靠紅色熒光標(biāo)簽,通過空斑實(shí)驗(yàn)重復(fù)篩選和純化缺失病毒株。純化后傳代20代,通過特異性gE,gB,TK基因PCR檢測純化病毒株,并結(jié)合熒光倒置顯微鏡下觀察的缺失病毒株細(xì)胞病變結(jié)果,綜合判定本次試驗(yàn)成功構(gòu)建了一株帶有綠色熒光和紅色熒光標(biāo)簽的PRV XJ gI/gE/TK三基因缺失病毒株。PRV XJ gI/gE/TK三基因缺失株傳代穩(wěn)定性鑒定結(jié)果表明,缺失株傳代過程穩(wěn)定,沒有外源病毒污染,不會因... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

Puc57質(zhì)粒圖譜

2.3.4 TransIT-X2 Dynamic Delivery System 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞及同源重組使用核酸蛋白儀測定獲得的Puc57-TK-RED質(zhì)粒和PRV XJ gE/gI雙基因缺失株總 DNA 的濃度及純度。使用 TransIT-X2 Dynamic Delivery System 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行 PRV-XJ gE/gI 雙基因缺失株 DNA 和 PUC57-TK-RED 質(zhì)粒DNA 共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，具體操作步驟及流程如圖 2-2。調(diào)節(jié)各試劑劑量以不斷優(yōu)化共轉(zhuǎn)染效果，通過同源重組的方式完成 PRV-XJ gE/gI 雙基因缺失株 TK基因的缺失，缺失示意圖如圖 2-3。

圖 2-3 缺失構(gòu)建示意圖Fig.2-3 Missing sketch map2.3.5 PRV XJ gI/gE/ TK 三基因缺失株的篩選及純化對共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行觀察，通過熒光標(biāo)記篩選缺失成功細(xì)胞并進(jìn)一步純化，操作步驟如下：1）待共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞出現(xiàn)病變，并在熒光倒置顯微鏡下同時發(fā)現(xiàn)熒光時，收集該孔細(xì)胞液，并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)后收集病毒液。2）將病毒液梯度稀釋至 10-3-10-7，接種于 12 孔板的 BHK21 細(xì)胞，每個稀釋梯度接種 2 孔，每孔接種 500μl，每隔 20min 來回?fù)u晃細(xì)胞板，4~6h 后棄上清液，并且 PBS 清洗 2~3 次。3）將預(yù)熱至 42℃的 1.5％無菌低熔點(diǎn)瓊脂糖與 2×DMEM 按 1：1 混合，將混合后的營養(yǎng)液鋪至每個孔中，置于 4℃靜置 20~30min，凝固后置于 37℃、5％CO2

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號：3240450