分枝桿菌,經(jīng)研究證實(shí)歸為革蘭氏陽性抗酸桿菌中的一類,作為常在菌生存于日常生活環(huán)境之中。分枝桿菌也可以分成許多種類,其中一類因?yàn)橛泄餐目乖鞍卓蓸?gòu)成結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。大多數(shù)分枝桿菌的菌株生長極為緩慢,有些能夠引起人和動(dòng)物結(jié)核及結(jié)核樣疾病。牛結(jié)核分枝桿菌特有的早期感染標(biāo)識(shí)性分泌蛋白是MPB 70和MPB 83蛋白,它們主要應(yīng)用于在菌株的鑒定和疫苗的研究之中。在利用DNAstar7.0軟件綜合分析牛型結(jié)核分枝桿菌早期標(biāo)識(shí)性分泌性蛋白MPB 70和MPB 83抗原基礎(chǔ)上,篩選確定了 MPB 70和MPB 83蛋白編碼基因主要抗原域,利用重疊延伸PCR技術(shù),構(gòu)建了 MPB 70和MPB 83串聯(lián)重組體。將其連接到原核表達(dá)載體pGEX-6p-1,進(jìn)行誘導(dǎo)和表達(dá)。研究獲得了一種具有抗原性的牛結(jié)核分枝桿菌感染早期標(biāo)識(shí)物MPB 70和MPB 83分泌性蛋白的串聯(lián)抗原,利用DNAstar7.0生物信息軟件對(duì)牛結(jié)核分枝桿菌感染早期標(biāo)識(shí)性分泌性蛋白MPB 70和MPB 83抗原結(jié)構(gòu)區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè),并設(shè)計(jì)合成克隆引物,構(gòu)建重組后的載體得到了高效表達(dá),再加上單克隆抗體的順利制備,檢測(cè)純化后重組蛋白的純度及抗體效... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古民族大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：48 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖四雙酶切鑒定重組質(zhì)粒??２５０??１００＋Ｂ??

?內(nèi)蒙古民族大學(xué)碩士學(xué)位論文?２１??１２?３?４??ｔ＞ｐ?ｂｐ??２０００＋?Ｊ??ｌ通＿?＾??１０＂ａｒ＾ｉ??圖３?ＭＰＢ?７０、ＭＰＢ?８３主要抗原域基因Ｏｖｅｒ－ＰＣＲ融合結(jié)果??Ｆｉｇｕｒｅ?３?Ｏｖｅｒ－ＰＣＲ?ｆｕｓｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ＭＰＢ７０?ａｎｄ?ＭＰＢ８３?ｍａｊｏｒ?ａｎｔｉｇｅｎ?ｄｏｍａｉｎ?ｇｅｎｅｓ??１．ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ?２０００；?２．?ＭＰＢ?７０基因抗原區(qū)域擴(kuò)增；３．?ＭＰＢ?８３基因抗原區(qū)擴(kuò)增：４．?ＭＰＢ?７０＋ＭＰＢ?８３融合基??因擴(kuò)增??３１３?重組原核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定??回收ＭＰＢ?７０＋ＭＰＢ?８３融合基因片段，經(jīng)ＢａｍＨ?Ｉ、Ｘｈｏ?Ｉ酶切位點(diǎn)定向引入??ｐＧＥＸ－６ｐ－ｌ，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選后獲得重組表達(dá)載體ｐＧＥＸ－６ｐ－ｌ／ＭＰＢ７０＋ＭＰＢ８３，雙酶??切重組質(zhì)粒可見９６６?ｂｐ和４９６６?ｂｐ兩條帶（圖４），重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序結(jié)果表明ＭＰＢ??７０＋ＭＰＢ?８３融合基因無堿基突變和缺失（圖５），重組載體構(gòu)建成功。??１２?３?４??ｂｐ?ｂｐ??７５０??５００－＞Ｅ??２５０??１００＋Ｂ??圖四雙酶切鑒定重組質(zhì)粒??Ｆｉｇｕｒｅ?４?Ｄｏｕｂｌｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｔｏ?ｉｄｅｎｔｉｆｙ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ??１．ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ?２０００；?２－３．?ｐＧＥＸ－６Ｐ－１／ＭＰＢ?７０＋ＭＰＢ?８３?質(zhì)粒雙酶切結(jié)果；４．?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ?１５０００??

感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)終濃??度為１．０?ｍＭ／Ｌ的ＩＰＴＧ誘導(dǎo)表達(dá)５?ｈ后，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳顯示，在約５８?ｋｕ處出??現(xiàn)目的條帶，可溶性鑒定顯示，目的蛋白上清和沉淀中均有表達(dá)產(chǎn)物存在，破碎后??菌體上清經(jīng)ＧＳＴ－Ｔｒａｐ填料親和層析純化后，ＢＣＡ法測(cè)定蛋白濃度為１．２?ｍｇ／ｍ?Ｌ，??表達(dá)目的融合蛋白可被ＧＳＴ標(biāo)簽單克隆抗體所識(shí)別，表明目的基因獲得有效表（圖??６）?〇??ｋｕ?Ｍ?１?２?３?４?５?６??－?－?？？?—??２５?？??ｉｓ??１４隹??圖６?重組蛋白表達(dá)及Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ鑒定??Ｆｉｇｕｒｅ?６?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ａｎｄ?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ??Ｍ：蛋白Ｍａｒｋｅｒ；?１：未誘導(dǎo)重組菌；２：誘導(dǎo)后重組菌；３：誘導(dǎo)后菌體上清；４：誘導(dǎo)后菌體沉淀；５：純化后??融合蛋白??Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｓｔａｎｄａｒｄ?（１４？１１６?ｋｕ）?；?１．Ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ?ｐＧＥＸ－６ｐ－１／ＭＰＢ７０＋ＭＰＢ８３；?２．?Ｉｎｄｕｃｅｄ??ｐＧＥＸ－６ｐ－１／ＭＰＢ７０＋ＭＰＢ８３；?３．?Ｌｙｓｉｓ?ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ；?４．?Ｌｙｓｉｓ?ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；?５．?ｆｕｓｉｏｎ?ｐｒｏｔｅｉｎ；?６．ｐｕｆｉｅｄ?ｆｕｓｉｏｎ??ｐｒｏｔｅｉｎ?ｉｎｔｅｒａｃｔ?ｗｉｔｈ?ＧＳＴ?ｌａｂｅＩ?Ｉ?ｉｎｇ?ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]牛分枝桿菌新型雞尾酒抗原診斷方法的建立及其初步應(yīng)用[D]. 陳爽.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[2]牛分枝桿菌主要分泌性蛋白70和脂蛋白83的克隆表達(dá)及抗原性研究[D]. 趙海.中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 2010



本文編號(hào)：3234725