通過比對新城疫病毒強(qiáng)、弱毒株F基因序列,根據(jù)其在F0裂解位點(diǎn)的差異以及F基因保守序列設(shè)計(jì)合成NDV-V-probe和NDV-L-probe探針組和NDV-F、NDV-R引物組,以基因Ⅶ型NA-1株和基因Ⅱ型LaSota疫苗株病毒RNA作為定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)品,建立檢測方法。對所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析,相關(guān)系數(shù)R2均為0.997,線性關(guān)系良好。通過計(jì)算變異系數(shù)CV/%分別為0.034%和0.027%,均小于1%,說明穩(wěn)定性良好。對禽類常見病毒IBV、H9亞型AIV檢測未發(fā)現(xiàn)有交叉反應(yīng),特異性好、重復(fù)性佳。結(jié)果表明:成功建立了新城疫病毒強(qiáng)、弱毒雙重?zé)晒舛縍T-PCR的檢測方法,實(shí)現(xiàn)了從分子水平上快速鑒別強(qiáng)、弱毒力的新城疫病毒,也可快速區(qū)分野毒感染動物和疫苗接種動物,減少不必要的經(jīng)濟(jì)損失。 

【文章來源】：中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2017,37(01)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

圖１目的基因擴(kuò)增Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；泳道１～５．強(qiáng)毒株的擴(kuò)增目的片段；６～９．弱毒株的擴(kuò)增目的片

２．３標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立按２．２優(yōu)化的反應(yīng)條件，將標(biāo)準(zhǔn)品１０倍梯度倍比稀釋后，分別得到１．０×１０７～１．０１ｃｏｐｉｅｓ／μＬ的標(biāo)準(zhǔn)品模板，以確立的擴(kuò)增體系進(jìn)行反應(yīng)。根據(jù)擴(kuò)增曲線，分別以Ｃｔ為Ｙ軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為Ｘ軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖５、６），線性關(guān)系分別為ｙ＝－３．３６ｘ＋４１．８５和ｙ＝－３．４３ｘ＋３８．３５，Ｒ２均為０．９９７。線性關(guān)系良好。圖４ＪＯＥ通道引物濃度的優(yōu)化１～４．０．２，０．４，０．６，０．８μｍｏｌ／Ｌ；５．陰性對照圖５ＮＡ－１株ＲＮＡ標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線２．４敏感性試驗(yàn)將ＲＮＡ標(biāo)準(zhǔn)品以１０倍梯度倍比稀釋，分別得到１．０×１０７～１．０１ｃｏｐｉｅｓ／μＬ的標(biāo)準(zhǔn)品；熒光定量ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果圖見圖７和圖８，最低圖６ＬａＳｏｔａ株ＲＮＡ標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測濃度分別為１．０×１０２ｃｏｐｉｅｓ／μＬ和１．０×１０１ｃｏｐｉｅｓ／μＬ。圖７ＦＡＭ通道敏感性試驗(yàn)１～８．１．０×１０７～１．０１ｃｏｐｉｅｓ／μＬ；９．陰性對照４中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)２０１７年１月第３７卷第１期ＣｈｉｎＪＶｅｔＳｃｉＪａｎ．２０１７Ｖｏｌ．３７Ｎｏ．１

２．３標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立按２．２優(yōu)化的反應(yīng)條件，將標(biāo)準(zhǔn)品１０倍梯度倍比稀釋后，分別得到１．０×１０７～１．０１ｃｏｐｉｅｓ／μＬ的標(biāo)準(zhǔn)品模板，以確立的擴(kuò)增體系進(jìn)行反應(yīng)。根據(jù)擴(kuò)增曲線，分別以Ｃｔ為Ｙ軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為Ｘ軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖５、６），線性關(guān)系分別為ｙ＝－３．３６ｘ＋４１．８５和ｙ＝－３．４３ｘ＋３８．３５，Ｒ２均為０．９９７。線性關(guān)系良好。圖４ＪＯＥ通道引物濃度的優(yōu)化１～４．０．２，０．４，０．６，０．８μｍｏｌ／Ｌ；５．陰性對照圖５ＮＡ－１株ＲＮＡ標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線２．４敏感性試驗(yàn)將ＲＮＡ標(biāo)準(zhǔn)品以１０倍梯度倍比稀釋，分別得到１．０×１０７～１．０１ｃｏｐｉｅｓ／μＬ的標(biāo)準(zhǔn)品；熒光定量ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果圖見圖７和圖８，最低圖６ＬａＳｏｔａ株ＲＮＡ標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測濃度分別為１．０×１０２ｃｏｐｉｅｓ／μＬ和１．０×１０１ｃｏｐｉｅｓ／μＬ。圖７ＦＡＭ通道敏感性試驗(yàn)１～８．１．０×１０７～１．０１ｃｏｐｉｅｓ／μＬ；９．陰性對照４中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)２０１７年１月第３７卷第１期ＣｈｉｎＪＶｅｔＳｃｉＪａｎ．２０１７Ｖｏｌ．３７Ｎｏ．１

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]新城疫流行病學(xué)新特點(diǎn)及鵝新城疫防控策略[J]. 丁壯,尹仁福,薛聰,王建忠,錢晶.  中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2015(01)
[3]鵝源新城疫病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立[J]. 尹仁福,劉新鑫,丁壯,劉美,吳昊.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2008(04)
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[5]雞新城疫病毒強(qiáng)弱毒株RT-PCR鑒別診斷方法[J]. 曹殿軍,劉培欣,閆麗輝,孫建宏.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2000(06)



本文編號：3232510