日本乙型腦炎（Japanese encephalitis,JE）,是由乙型腦炎病毒引起的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。該病可以感染人和多種動(dòng)物,并造成不可逆的神經(jīng)損害。2006年在我國山西運(yùn)城發(fā)生流行性乙型腦炎,造成60人感染,其中19人死亡,社會影響巨大。在動(dòng)物的感染中,豬群最易感染,懷孕母豬可表現(xiàn)為流產(chǎn)、高熱、死胎,公豬則出現(xiàn)睪丸炎,給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,因此日本乙型腦炎成為嚴(yán)重的公共安全問題。到目前為止,還沒有針對JEV的特異性治療藥物,所以,尋找治療JEV的藥物和方法是非常必要的。JEVNS3蛋白酶在JEV多聚蛋白水解過程中起著重要的作用,是乙型腦炎病毒復(fù)制所必需的。因此NS3蛋白酶己經(jīng)被很多研究者們所關(guān)注,成為一個(gè)治療乙型腦炎的潛在藥物靶標(biāo)。目前針對HCV NS3蛋白酶為靶標(biāo)已篩選出藥物特拉匹韋（telaprevir,VX-950）和波普瑞韋（boceprevir,SCH-503034）,然而針對JEV蛋白酶抑制劑的研究幾乎還沒有報(bào)道。本研究大量純化了可溶性的JEV NS3蛋白酶,并且用熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法（FRET）檢測了此蛋白酶的活性,在此基礎(chǔ)上建立了高通量篩選方法。對實(shí)... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 日本乙型腦炎的流行病學(xué)
    1.2 日本乙型腦炎病毒的分子生物學(xué)研究
    1.3 黃病毒NS2B/NS3蛋白酶的功能研究
    1.4 黃病毒NS2B/NS3蛋白酶復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)研究
    1.5 NS2B/NS3蛋白酶抑制劑的研究進(jìn)展
    1.6 藥物高通量篩選的研究和分子碎片藥物的設(shè)計(jì)
        1.6.1 藥物高通量篩選的研究
        1.6.2 分子碎片藥物設(shè)計(jì)
第二章 研究目的與意義
第三章 JEV NS3蛋白酶抑制劑的高通量篩選
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 質(zhì)粒和菌株
        3.1.2 熒光底物的設(shè)計(jì)
        3.1.3 相關(guān)試劑和藥品
        3.1.4 抗生素和培養(yǎng)基的配制
        3.1.5 緩沖液及各種試劑的配制
        3.1.6 化合物庫
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        3.2.2 質(zhì)粒的提取和酶切鑒定
        3.2.3 重組蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)、純化
        3.2.4 蛋白酶濃度的測定(BCA法)
        3.2.5 蛋白酶的活性檢測及高通量篩選體系的確定
        3.2.6 DMSO對JEV NS2B/NS3蛋白酶活性的影響
        3.2.7 Aprotinin對NS2B/NS3蛋白酶的抑制作用
        3.2.8 基于JEV NS3蛋白酶活性的小分子抑制劑篩選
            3.2.8.1 化合物碎片庫的初篩
            3.2.8.2 化合物碎片庫的復(fù)篩
            3.2.8.3 陽性抑制劑對WNV和DENV NS2B/NS3pro的抑制效果
        3.2.9 基于細(xì)胞水平的蛋白酶抑制劑的抗病毒活性研究
            3.2.9.1 化合物抑制JEV的細(xì)胞病變效應(yīng)
            3.2.9.2 Western blot分析小分子化合物的抗病毒活性
            3.2.9.3 間接免疫熒光試驗(yàn)
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 質(zhì)粒的雙酶切鑒定
        3.3.2 三種病毒的NS2B/NS3Pro的Ni~(2+)-親和層析純化
        3.3.3 蛋白酶的酶切活性檢測
        3.3.4 DMSO對JEV NS2B/NS3蛋白酶活性的影響
        3.3.5 Aprotinin對NS2B/NS3蛋白酶的抑制
        3.3.6 蛋白酶抑制劑高通量篩選
            3.3.6.1 小分子碎片庫的初步篩選
            3.3.6.2 小分子化合物的復(fù)篩
            3.3.6.3 陽性化合物對WNV、DENV NS2B/NS3pro的抑制效果
        3.3.7 基于細(xì)胞水平的蛋白酶抑制劑的抗病毒活性研究
            3.3.7.1 化合物抑制JEV的細(xì)胞病變效應(yīng)
            3.3.7.2 Western blot試驗(yàn)
            3.3.7.3 間接免疫熒光試驗(yàn)
            3.3.7.4 化合物與蛋白互作位點(diǎn)的預(yù)測
    3.4 討論
        3.4.1 蛋白酶在E.coli中的表達(dá)和純化
        3.4.2 小分子抑制劑的高通量篩選
        3.4.3 陽性抑制劑在WNV、DENV NS2B/NS3蛋白酶上的抑制
        3.4.4 陽性抑制劑在細(xì)胞水平上的抗病毒研究
    3.5 結(jié)論
第四章 JEV NS3蛋白酶單克隆抗體的制備
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        4.1.2 主要藥品及試劑
        4.1.3 主要培養(yǎng)基及其配制
        4.1.4 主要緩沖溶液及其配制
    4.2 試驗(yàn)方法
        4.2.1 免疫原和檢測抗原的制備
        4.2.2 動(dòng)物免疫
        4.2.3 間接ELISA檢測方法的建立
        4.2.4 間接ELISA方法檢測免疫小鼠的血清效價(jià)
        4.2.5 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的制備
        4.2.6 免疫脾細(xì)胞的制備
        4.2.7 細(xì)胞融合
        4.2.8 陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選
        4.2.9 陽性雜交瘤細(xì)胞的亞克隆
        4.2.10 雜交瘤細(xì)胞的凍存
        4.2.11 單克隆抗體的大量制備
        4.2.12 單克隆抗體的效價(jià)鑒定
        4.2.13 單克隆抗體的間接免疫熒光檢測
        4.2.14 單克隆抗體的Western blot檢測
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 間接ELISA檢測方法的建立
        4.3.2 免疫小鼠血清效價(jià)測定
        4.3.3 雜交瘤細(xì)胞株的篩選與建立
        4.3.4 單克隆抗體的效價(jià)測定
        4.3.5 單克隆抗體的間接免疫熒光檢測
        4.3.6 單克隆抗體的Western blot分析
    4.4 討論
        4.4.1 動(dòng)物免疫
        4.4.2 細(xì)胞融合
        4.4.3 特異性單克隆抗體的篩選
        4.4.4 單克隆抗體特異性的鑒定
    4.5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：3229116