鴨坦布蘇病毒（Duck tembusu virus,DTMUV）、鴨瘟病毒（Duck plague virus,DPV）、鴨甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）血清1型（DHAV-1）和3型（DHAV-3）均為危害養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展的重要病毒性病原,為了快速檢測這幾種病毒。本研究建立了DTMUV、DPV、DHAV-1和DHAV-3的一步法多重RTPCR檢測方法,并對該方法的靈敏度、特異性和重復(fù)性等要素進(jìn)行評估,并將建立的方法應(yīng)用于病料的鑒別診斷,結(jié)果如下:1.DTMUV、DPV、DHAV-1和DHAV-3一步法多重RT-PCR檢測方法的建立根據(jù)DTMUV、DPV、DHAV-1和DHAV-3在GenBank上全基因組保守序列設(shè)計四對引物,以4種病毒的核酸為模板,通過對反應(yīng)退火溫度和引物濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了一步法多重RT-PCR方法,分別能擴(kuò)增出322bp、804bp、648bp和1314bp的目的片段。特異性試驗結(jié)果顯示:以鴨乙肝病毒、禽流感病毒、鴨圓環(huán)病毒、鵝細(xì)小病毒、鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和健康鴨脾臟組織為模板的擴(kuò)增結(jié)果均為... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：49 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

單一RT-PCR的擴(kuò)增

觀察每個反應(yīng)最佳退火溫度，結(jié)果如圖2 所示，DHAV-3 在退火溫度為 55.3℃時，條帶最明顯，DPV 和 DHAV-1 在涌道 1~8均清晰，未見明顯差異，DTMUV 在退火溫度為 57.5 ℃時，反應(yīng)條帶效果最佳。圖 2 單一 RT-PCR 的退火溫度優(yōu)化Fig.2 Optimization of annealing temperature for the single RT-PCRM 泳道：DL2000 Marker；泳道 1~8 的反應(yīng)退火溫度分別為：泳道 1：51.0℃；泳道 2：51.5℃；泳道 3：52.3℃；泳道 4：53.7℃；泳道 5：55.3℃；泳道 6：56.6℃；泳道 7：57.5℃；泳道 8：58.0℃Lane M: DL2000 Marker; Lane 1: 51.0℃; Lane 2: 51.5℃; Lane 3: 52.3℃; Lane 4: 53.7℃; Lane 5:55

.3 一步法多重 RT-PCR 反應(yīng)退火溫度優(yōu)化結(jié)果參考單一 RT-PCR 的退火溫度的結(jié)果選擇六個退火溫度（51.5℃，52.3℃，53.75.3℃，56.6℃，57.5℃）進(jìn)行試驗，從六種退火溫度下的反應(yīng)結(jié)果可以看出，在參考 Tm 值的退火溫度的六個退火溫度下均可見四條清晰的特異性條帶，對于多T-PCR 的影響不算特別大，綜合所有條帶分析，在退火溫度為 55.3 ℃和 56.6 ℃帶最清晰。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]Ⅰ型鴨肝炎病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法的建立及其在臨床上的初步應(yīng)用[D]. 胡成.揚(yáng)州大學(xué) 2016
[2]1型和3型鴨甲肝病毒在臨床死亡雛鴨體內(nèi)分布的研究[D]. 林少莉.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[3]坦布蘇病毒的分離鑒定及熒光定量RT-PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[D]. 于春梅.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[4]嗜酸菌DNA與RNA同時提取方法的研究[D]. 謝成.中南大學(xué) 2012



本文編號：3223113