木聚糖是半纖維素的主要組成成分,而半纖維素廣泛存在于植物細(xì)胞壁中,是自然界中含量?jī)H次于纖維素的可再生資源。多種谷物飼料如小麥、大麥、燕麥等含有較多的木聚糖,影響了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用與吸收,因此選擇合適的木聚糖酶來(lái)降解木聚糖就十分必要。微生物產(chǎn)生的天然木聚糖酶酶多為混合酶,其產(chǎn)量和酶活較低制約了木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用,采用基因工程技術(shù)獲得活力好、產(chǎn)量高、性質(zhì)穩(wěn)定的木聚糖酶資源成為研究的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,將目的基因片段克隆到PMD19-T載體上,經(jīng)測(cè)序檢測(cè)后,與GenBank中已公布木聚糖酶基因序列對(duì)比發(fā)現(xiàn),該木聚糖酶基因與已公布序列（黑曲霉Aspergillus niger C71（JF693944.1））的同源性高達(dá)100%,該基因的編碼區(qū)不含信號(hào)肽序列,不含內(nèi)含子序列,推測(cè)編碼225個(gè)氨基酸,蛋白分子量約為24.13 kDa,蛋白等電點(diǎn)約為5.23。構(gòu)建真核表達(dá)載體后,將其電擊轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定,最終證實(shí)pGAPZaA-木聚糖酶基因重組質(zhì)粒載體已成功整合入畢赤酵母中,重組酵母可分泌與預(yù)期目的蛋白大小相當(dāng)?shù)拿傅鞍讞l帶,證實(shí)了木聚糖酶基因在畢赤酵母中得到了成功表... 

【文章來(lái)源】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南省

【文章頁(yè)數(shù)】：72 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 NSP、木聚糖及其降解酶
        1.1.1 NSP與木聚糖
        1.1.2 木聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)特性
        1.1.3 木聚糖酶及其分類
    1.2 木聚糖酶基因的研究進(jìn)展
        1.2.1 木聚糖酶基因的克隆
            1.2.1.1 木聚糖酶基因的克隆方法
            1.2.1.2 陽(yáng)性克隆子的檢測(cè)方法
            1.2.1.3 克隆的木聚糖酶基因
        1.2.2 木聚糖酶基因的表達(dá)體系
            1.2.2.1 細(xì)菌表達(dá)體系
            1.2.2.2 真菌表達(dá)體系
    1.3 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)越性
    1.4 易錯(cuò)PCR技術(shù)
    1.5 木聚糖酶的應(yīng)用
        1.5.1 木聚糖酶在造紙行業(yè)的應(yīng)用
        1.5.2 木聚糖酶在飼料行業(yè)的應(yīng)用
        1.5.3 木聚糖酶在食品行業(yè)的應(yīng)用
        1.5.4 木聚糖酶的其他應(yīng)用
    1.6 研究目的及意義
第二章 木聚糖酶基因的克隆及鑒定
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 試驗(yàn)儀器
        2.1.2 試驗(yàn)菌種與質(zhì)粒
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 培養(yǎng)基和溶液
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 引物設(shè)計(jì)
        2.2.2 目的基因的獲取
            2.2.2.1 黑曲霉(Aspergillus niger)的培養(yǎng)
            2.2.2.2 黑曲霉總RNA的提取
            2.2.2.3 去除黑曲霉總RNA樣品中的基因組DNA
            2.2.2.4 RT-PCR
        2.2.3 RT-PCR產(chǎn)物的純化與回收
        2.2.4 RT-PCR產(chǎn)物與PMD19-T載體的連接
        2.2.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.2.6 陽(yáng)性克隆子的篩選與鑒定
            2.2.6.1 藍(lán)白斑篩選
            2.2.6.2 菌落PCR鑒定
            2.2.6.3 重組質(zhì)粒的提取及檢測(cè)
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 黑曲霉木聚糖酶基因組總RNA的提取結(jié)果
        2.3.2 黑曲霉木聚糖酶基因RT-PCR的擴(kuò)增結(jié)果
        2.3.3 重組克隆子的藍(lán)白斑篩選結(jié)果
        2.3.4 重組克隆子的鑒定
            2.3.4.1 重組克隆子菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果
            2.3.4.2 重組克隆子質(zhì)粒提取及雙酶切鑒定結(jié)果
            2.3.4.3 重組克隆子質(zhì)粒檢測(cè)結(jié)果
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 木聚糖酶基因真核表達(dá)載體電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母
    3.1 試驗(yàn)材料
        3.1.1 試驗(yàn)儀器
        3.1.2 試驗(yàn)菌種與質(zhì)粒
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA的圖譜
        3.1.5 培養(yǎng)基與溶液
            3.1.5.1 培養(yǎng)基的配制
            3.1.5.2 溶液的配制
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 術(shù)聚糖酶基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.2.1.1 黑曲霉木聚糖酶基因的純化與回收
            3.2.1.2 真核表達(dá)載體pGAPZαA的純化與回收
            3.2.1.3 木聚糖酶基因和真核表達(dá)載體pGAPZαA質(zhì)粒的連接
            3.2.1.4 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌
            3.2.1.5 重組克隆子的篩選與鑒定
        3.2.2 重組pGAPZαA-木聚糖酶基因質(zhì)粒的電擊轉(zhuǎn)化
            3.2.2.1 重組pGAPZαA-木聚糖酶基因質(zhì)粒的線性化
            3.2.2.2 畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備
            3.2.2.3 電擊轉(zhuǎn)化
            3.2.2.4 重組酵母菌的鑒定
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 木聚糖酶基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果
            3.3.1.1 重組克隆子的平板篩選結(jié)果
            3.3.1.2 重組表達(dá)載體pGAPZαA-木聚糖酶基因的鑒定
        3.3.2 重組酵母菌的鑒定
            3.3.2.1 重組酵母菌的抗性篩選結(jié)果
            3.3.2.2 重組畢赤酵母菌的菌落PCR鑒定結(jié)果
            3.3.2.3 SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)結(jié)果
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 重組畢赤酵母產(chǎn)酶活性的檢測(cè)
    4.1 試驗(yàn)材料
        4.1.1 試驗(yàn)儀器
        4.1.2 試驗(yàn)菌種
        4.1.3 主要試劑
        4.1.4 培養(yǎng)基與溶液
            4.1.4.1 培養(yǎng)基配制
            4.1.4.2 溶液的配制
    4.2 試驗(yàn)方法
        4.2.1 重組酵母菌平板檢測(cè)結(jié)果
        4.2.2 木聚糖酶活力的檢測(cè)方法
            4.2.2.1 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定
            4.2.2.2 木聚糖酶活力的測(cè)定方法
        4.2.3 不同碳源對(duì)重組酵母產(chǎn)酶活力的測(cè)定
            4.2.3.1 粗酶液的制備
            4.2.3.2 木聚糖酶活力的檢測(cè)
        4.2.4 不同重組酵母的產(chǎn)酶活力的測(cè)定
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 重組酵母菌平板檢測(cè)結(jié)果
        4.3.2 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線
        4.3.3 不同碳源對(duì)重組酵母菌木聚糖酶活性的影響
        4.3.4 不同重組酵母菌產(chǎn)酶活力的測(cè)定結(jié)果
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 利用易錯(cuò)PCR改變木聚糖酶基因
    5.1 試驗(yàn)材料
    5.2 試驗(yàn)方法
        5.2.1 引物設(shè)計(jì)
        5.2.2 木聚糖酶基因易錯(cuò)PCR擴(kuò)增、轉(zhuǎn)化及鑒定方法
            5.2.2.1 質(zhì)粒PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的純化與回收
            5.2.2.2 易錯(cuò)PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的純化與回收
            5.2.2.3 突變基因的克隆與篩選
        5.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 易錯(cuò)PCR擴(kuò)增結(jié)果
            5.3.1.1 質(zhì)粒PCR擴(kuò)增及易錯(cuò)PCR擴(kuò)增結(jié)果
            5.3.1.2 重組克隆子的藍(lán)白斑篩選結(jié)果
            5.3.1.3 重組克隆子的鑒定
        5.3.2 木聚糖酶突變基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果
            5.3.2.1 重組克隆子的平板篩選結(jié)果
            5.3.2.2 重組表達(dá)載體pGAPZαA-木聚糖酶突變體基因的鑒定
        5.3.3 重組酵母菌的鑒定
            5.3.3.1 重組酵母菌的抗性篩選結(jié)果
            5.3.3.2 重組酵母的PCR鑒定結(jié)果
            5.3.3.3 SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)結(jié)果
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
第六章 突變株和原始基因重組酵母產(chǎn)酶活性及酶學(xué)性質(zhì)的分析
    6.1 試驗(yàn)材料
        6.1.1 試驗(yàn)儀器
        6.1.2 試驗(yàn)菌種
        6.1.3 主要試劑及培養(yǎng)基
    6.2 試驗(yàn)方法
        6.2.1 不同重組酵母菌產(chǎn)酶活力的測(cè)定方法
            6.2.1.1 粗酶液的制備
            6.2.1.2 木聚糖酶活力的測(cè)定
        6.2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)重組酵母產(chǎn)酶活力影響
        6.2.3 木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)的分析
            6.2.3.1 不同溫度處理對(duì)木聚糖酶活力的影響
            6.2.3.2 不同pH處理對(duì)木聚糖酶活力的影響
        6.2.4 添加0.2%的Tween80對(duì)木聚糖酶活力的影響
        6.2.5 木聚糖酶對(duì)小麥中非淀粉多糖的降解
            6.2.5.1 色譜條件
            6.2.5.2 小麥的處理
            6.2.5.3 粗酶液的制備
    6.3 結(jié)果與分析
        6.3.1 不同突變株產(chǎn)酶活力的測(cè)定結(jié)果
        6.3.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)重組酵母產(chǎn)酶活力的影響
        6.3.3 不同溫度處理對(duì)木聚糖酶活力的影響
        6.3.4 不同pH處理對(duì)木聚糖酶活力的影響
        6.3.5 添加0.2%的Tween80對(duì)木聚糖酶活力的影響
        6.3.6 木聚糖酶對(duì)小麥中非淀粉多糖的降解結(jié)果
    6.4 討論
    6.5 小結(jié)
總結(jié)
參考文獻(xiàn)
Abstract


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]黑曲霉木聚糖酶基因xynB的克隆及在釀酒酵母中的表達(dá)[J]. 張水龍,陳東,曹樹(shù)威,吳仁智,黃日波.  廣西科學(xué). 2013(02)
[2]枯草芽孢桿菌木聚糖酶Xyn B在畢赤酵母中的表達(dá)[J]. 莫毅,梁方方,賴志強(qiáng),盧玉發(fā),廖玉英,何仁春,黃麗霞,楊琳.  中國(guó)飼料. 2012(09)
[3]基于易錯(cuò)PCR的黃曲霉毒素解毒酶體外分子定向進(jìn)化[J]. 張賽,邢克克,胡亞冬,謝春芳,劉大嶺,姚冬生.  生物工程學(xué)報(bào). 2011(07)
[4]麥芽糖誘導(dǎo)耐堿性木聚糖酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)[J]. 張?jiān)蒲?楊明明,周煌凱,段春燕,龔月生.  西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2011(01)
[5]黑曲霉木聚糖酶基因xynA的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 張茂,劉德武,林純,賀曉燕,孟繁明,周慶豐,杜云平,吳珍芳.  華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2010(05)
[6]黑曲霉木聚糖酶基因（xynB）的克隆及真核分泌表達(dá)[J]. 張茂,周慶豐,杜云平,劉德武,孟繁明,周美華,吳珍芳.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2010(02)
[7]極端耐熱木聚糖酶基因在枯草芽孢桿菌中的整合表達(dá)[J]. 張偉,李冠,婁愷.  生物技術(shù). 2010(01)
[8]不同類型日糧添加酶制劑對(duì)蛋品質(zhì)和蛋鴨生產(chǎn)性能的影響[J]. 王景成,楊維仁,楊在賓,丁永敏,姜淑貞,張桂國(guó).  中國(guó)糧油學(xué)報(bào). 2009(01)
[9]不同比例小麥日糧添加木聚糖酶對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響[J]. 鮑淑青,王敏,杜紅方,周鎮(zhèn)鋒.  飼料工業(yè). 2008(22)
[10]木聚糖酶XynⅡ的D37N突變、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)變化[J]. 周晨妍,李東峰,鄔敏辰,王武.  生物加工過(guò)程. 2008(03)

碩士論文
[1]木聚糖酶基因工程菌G81的構(gòu)建及酶學(xué)性質(zhì)研究[D]. 宋東鎣.河南師范大學(xué) 2010
[2]葡萄糖氧化酶的體外定向進(jìn)化[D]. 劉丹.中國(guó)科學(xué)院研究生院（武漢病毒研究所） 2007
[3]木聚糖酶對(duì)小麥日糧非淀粉多糖降解規(guī)律及其對(duì)肉仔雞腸道組織形態(tài)的影響研究[D]. 雷麗.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007



本文編號(hào)：3222120