單個(gè)B淋巴細(xì)胞的抗病毒抗體的篩選與鑒定
發(fā)布時(shí)間：2021-06-09 04:43
抗體作為機(jī)體獲得性免疫的重要工具,在體液免疫反應(yīng)中占有重要地位。由于其特異性與有效性,因此人們不斷嘗試通過(guò)各種體外表達(dá)技術(shù)獲得抗體,用于病毒病的研究與防治。從多克隆抗體制備技術(shù)到雜交瘤細(xì)胞技術(shù),再到基因工程抗體制備技術(shù)的發(fā)展中,人們發(fā)現(xiàn)抗體制備仍然面臨著難度大、耗時(shí)長(zhǎng)、異源性反應(yīng)等問(wèn)題。基于此,近年來(lái)發(fā)展出從一種單個(gè)B淋巴細(xì)胞制備抗體的新興技術(shù),該方法依賴于流式分選技術(shù),能夠在單個(gè)B淋巴細(xì)胞中分離表達(dá)出大量天然構(gòu)象的特異性抗體。本研究利用基于單個(gè)B淋巴細(xì)胞制備單克隆抗體技術(shù),分別開展抗O型FMDV抗體、抗CPV抗體與抗RABV人源抗體的制備與鑒定。在健康C57BL/6小鼠脾臟懸浮液中,利用泛B細(xì)胞表面標(biāo)記CD19的磁珠富集B細(xì)胞后,采用流式分選技術(shù)經(jīng)過(guò)B220+/IgG1+/CD38+/O型FMDV抗原+分選,以19/500000的比例獲得單個(gè)抗原特異性B細(xì)胞,隨后利用單細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄-巢式PCR反應(yīng),擴(kuò)增獲得8個(gè)抗體輕鏈可變區(qū)完整基因片段與19個(gè)抗體重鏈可變區(qū)完整基因片段,陽(yáng)性比例分別為33.3%與7...
【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市
【文章頁(yè)數(shù)】：70 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
A抗體的結(jié)構(gòu)
中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言第一章 引 言1.1 抗體1.1.1 抗體的結(jié)構(gòu)抗體作為一種免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig），其結(jié)構(gòu)是由兩條重鏈（H 鏈）和兩條輕鏈（L 鏈）構(gòu)成，并分別含有各自的恒定區(qū)（Constant region, C 區(qū)）和可變區(qū)（Variable region, V 區(qū)）；輕鏈較短，分子量約為 25 kD，大約由 210 個(gè)氨基酸組成，重鏈相對(duì)較長(zhǎng)，分子量約為 55 kD，由 450-550 個(gè)氨基酸組成，其中包含有一個(gè) V 區(qū)和 3-4 個(gè) C 區(qū)，同時(shí)他們相互之間由半胱氨酸殘基形成的二硫鍵連接（Wade et al., 1997）。用木瓜蛋白酶消化后可得到兩個(gè)相同的 Fab 片段與一個(gè) Fc 片段(圖 1.1A)。C 區(qū)氨基酸序列基本保持不變，其主要功能是提供效應(yīng)細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)，激活補(bǔ)體，提供轉(zhuǎn)運(yùn)位點(diǎn)等；V 區(qū)氨基酸序列變化較大，根據(jù)氨基酸變異程度又分為三個(gè)高變區(qū)（complementarity determining region, CDR）與四個(gè)骨架區(qū)（framework region, FR）（Schroeder eal., 2010）(圖 1.1B)。
分選技術(shù)（Magnetic activated cell sorting, MACS）是一種通過(guò)磁株標(biāo)記能夠有活性且功能活躍的細(xì)胞的方法（圖 1.5）。MACS 由 MACS 磁珠、MAC組成，當(dāng) MACS 柱被放置在 MACS 分離器(強(qiáng)永磁體)中時(shí)，在柱基質(zhì)中誘其強(qiáng)度足以保留標(biāo)記有最低數(shù)量 MACS 磁珠的細(xì)胞，未標(biāo)記的細(xì)胞則會(huì)通過(guò)取下 MACS 柱后，被標(biāo)記的細(xì)胞就會(huì)釋放出來(lái)。因此，利用 MACS 技術(shù)，組分都可以很容易地分離出來(lái)并得到高純度的細(xì)胞。整個(gè)過(guò)程不超過(guò) 30min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)(Dainiak et al., 2007)。MACS 技術(shù)的標(biāo)記可分為直接標(biāo)記和間可分為正向分選與負(fù)向分選。熒光染色偶聯(lián) MACS 抗體可同時(shí)用于流式細(xì)胞、分離細(xì)胞組分。目前 MACS 技術(shù)已經(jīng)成為細(xì)胞分離的標(biāo)準(zhǔn)方法，適用于各個(gè)室到臨床應(yīng)用，從小型試驗(yàn)到大型試驗(yàn)操作，從常見細(xì)胞類型到罕見細(xì)胞和量分離，MACS 技術(shù)均被廣泛應(yīng)用(Thelen et al., 2017)。圖 1.4 流式細(xì)胞熒光分選法Fig 1.4 The technology of FACS
本文編號(hào)：3219956
【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市
【文章頁(yè)數(shù)】：70 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
A抗體的結(jié)構(gòu)
中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言第一章 引 言1.1 抗體1.1.1 抗體的結(jié)構(gòu)抗體作為一種免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig），其結(jié)構(gòu)是由兩條重鏈（H 鏈）和兩條輕鏈（L 鏈）構(gòu)成，并分別含有各自的恒定區(qū)（Constant region, C 區(qū)）和可變區(qū)（Variable region, V 區(qū)）；輕鏈較短，分子量約為 25 kD，大約由 210 個(gè)氨基酸組成，重鏈相對(duì)較長(zhǎng)，分子量約為 55 kD，由 450-550 個(gè)氨基酸組成，其中包含有一個(gè) V 區(qū)和 3-4 個(gè) C 區(qū)，同時(shí)他們相互之間由半胱氨酸殘基形成的二硫鍵連接（Wade et al., 1997）。用木瓜蛋白酶消化后可得到兩個(gè)相同的 Fab 片段與一個(gè) Fc 片段(圖 1.1A)。C 區(qū)氨基酸序列基本保持不變，其主要功能是提供效應(yīng)細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)，激活補(bǔ)體，提供轉(zhuǎn)運(yùn)位點(diǎn)等；V 區(qū)氨基酸序列變化較大，根據(jù)氨基酸變異程度又分為三個(gè)高變區(qū)（complementarity determining region, CDR）與四個(gè)骨架區(qū)（framework region, FR）（Schroeder eal., 2010）(圖 1.1B)。
分選技術(shù)（Magnetic activated cell sorting, MACS）是一種通過(guò)磁株標(biāo)記能夠有活性且功能活躍的細(xì)胞的方法（圖 1.5）。MACS 由 MACS 磁珠、MAC組成，當(dāng) MACS 柱被放置在 MACS 分離器(強(qiáng)永磁體)中時(shí)，在柱基質(zhì)中誘其強(qiáng)度足以保留標(biāo)記有最低數(shù)量 MACS 磁珠的細(xì)胞，未標(biāo)記的細(xì)胞則會(huì)通過(guò)取下 MACS 柱后，被標(biāo)記的細(xì)胞就會(huì)釋放出來(lái)。因此，利用 MACS 技術(shù)，組分都可以很容易地分離出來(lái)并得到高純度的細(xì)胞。整個(gè)過(guò)程不超過(guò) 30min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)(Dainiak et al., 2007)。MACS 技術(shù)的標(biāo)記可分為直接標(biāo)記和間可分為正向分選與負(fù)向分選。熒光染色偶聯(lián) MACS 抗體可同時(shí)用于流式細(xì)胞、分離細(xì)胞組分。目前 MACS 技術(shù)已經(jīng)成為細(xì)胞分離的標(biāo)準(zhǔn)方法，適用于各個(gè)室到臨床應(yīng)用，從小型試驗(yàn)到大型試驗(yàn)操作，從常見細(xì)胞類型到罕見細(xì)胞和量分離，MACS 技術(shù)均被廣泛應(yīng)用(Thelen et al., 2017)。圖 1.4 流式細(xì)胞熒光分選法Fig 1.4 The technology of FACS
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