傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus, IBDV）屬于雙RNA病毒科,禽雙RNA病毒屬。它主要侵害3-12周齡的雛雞和青年雞,破壞法氏囊中淋巴濾泡未成熟的B細胞,導致免疫抑制,使得感染雞常常發(fā)生免疫失敗并且會增加對其他病原的易感性。由于其病毒基因組較小,編碼蛋白少,常被作為dsRNA的模式病毒進行深入研究。IBDV基因組為A和B兩個節(jié)段組成,分別編碼RNA依賴的RNA聚合酶VP1、衣殼蛋白VP2與VP3、病毒自身的蛋白酶VP4和非結(jié)構(gòu)蛋白VP5共五種蛋白。目前對于該病毒與宿主細胞相互作用的機制認識還相對有限,致病機制尚且不明。本研究以IBDV感染雞胚成纖維細胞DF-1為模型,應用亞細胞蛋白組學結(jié)合定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)—相對和絕對定量的等量異位標簽（iTRAQ）對IBDV感染細胞的蛋白表達變化進行探索。為了探索病毒與宿主細胞的相互作用,本研究以DF-1細胞為IBDV感染模型,采用iTRAQ新技術(shù)結(jié)合LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定的研究方法,分析細胞感染病毒后24小時的細胞質(zhì)、細胞核兩組亞細胞蛋白質(zhì)組表達變化動態(tài)。LC-MS/MS質(zhì)譜分析結(jié)果表明,胞質(zhì)... 

【文章來源】：浙江大學浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：130 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
論文創(chuàng)新點
摘要
Abstract
研究意義
技術(shù)路線
第一部分 文獻綜述
    第一章 雞傳染性法氏囊病病毒的研究進展
        1 IBDV的基因組結(jié)構(gòu)和編碼蛋白
            1.1 VP1蛋白
            1.2 VP2蛋白
            1.3 VP3蛋白
            1.4 VP4蛋白
            1.5 VP5蛋白
            1.6 5’-NCR和3’-NCR
        2 病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)、復制和繁殖
            2.1 病毒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)
            2.2 IBDV的復制和繁殖
        3 IBDV的致病性與免疫抑制
            3.1 IBDV的致病性
            3.2 IBDV引起的免疫抑制
        4 IBDV與宿主的相互作用研究
    第二章 定量蛋白質(zhì)組學及其在病毒學研究中的應用
        1 蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)
            1.1 定量蛋白質(zhì)組學
                1.1.1 熒光差異雙向電泳技術(shù)--DIGE
                1.1.2 細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標記技術(shù)--SILAC
                1.1.3 同位素親和標簽技術(shù)--ICAT
                1.1.4 同位素標記相對和絕對定量技術(shù)--iTRAQ
        2 亞細胞蛋白質(zhì)組學
            2.1 細胞核蛋白質(zhì)組學
                2.1.1 核膜蛋白質(zhì)組學
                2.1.2 核仁蛋白質(zhì)組學
                2.1.3 核孔復合物蛋白質(zhì)組
            2.2 線粒體蛋白質(zhì)組學
            2.3 細胞骨架蛋白質(zhì)組學
            2.4 膜蛋白質(zhì)組學
            2.5 其他細胞器蛋白質(zhì)組學
                2.5.1 高爾基體蛋白質(zhì)組學
                2.5.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)組學
                2.5.3 過氧化物酶體和溶酶體蛋白質(zhì)組學
    第三章 Rho GTPases蛋白研究進展
        1 Rho GTPases
            1.1 Rho GEFs
            1.2 Rho GAPs
            1.3 Rho GDIs
        2 Rho GTPases的信號途徑
            2.1 Rho GTPases的上游信號途徑
            2.2 Rho GTPases的下游信號途徑
                2.2.1 PAKs(p21-activated kinase)
                2.2.2 Rho連接激酶(Rho associated coiled-coiled kinase,ROCK)
                2.2.3 IQGApl(IQ motif containing GTPase-activating protein 1)
        3 Rho GTPases與細胞骨架
第二部分 研究內(nèi)容
    第一章 基于ITRAQ技術(shù)的傳染性法氏囊病病毒感染DF-1細胞的亞細胞蛋白組分析
        摘要
        1 材料與方法
            1.1 實驗材料
                1.1.1 毒株與細胞
                1.1.2 試劑與藥品
                1.1.3 抗體
                1.1.4 儀器和軟件
            1.2 實驗方法
                1.2.1 樣品制備
                    1.2.1.1 樣品準備
                    1.2.1.2 流式細胞儀對樣品感染率的檢測
                    1.2.1.3 預實驗SDS-PAGE電泳
                1.2.2 酶解和肽段定量
                1.2.3 肽段標記
                1.2.4 毛細管高效液相色譜
                1.2.5 質(zhì)譜鑒定
                1.2.6 數(shù)據(jù)分析
                    1.2.6.1 原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)及Maxquant數(shù)據(jù)庫搜索
                    1.2.6.2 定量分析
                1.2.7 生物信息學分析
                    1.2.7.1 層次聚類分析
                    1.2.7.2 差異蛋白的功能分類
                    1.2.7.3 構(gòu)建差異蛋白互作網(wǎng)絡分析
                1.2.8 引物設計
                1.2.9 Western blot驗證
                1.2.10 免疫熒光(IFA)驗證
        2 結(jié)果
            2.1 樣品制備
            2.2 預實驗SDS-PAGE電泳
            2.3 酶解肽段濃度測定
            2.4 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果
            2.5 差異表達蛋白的功能分類
            2.6 差異表達蛋白的轉(zhuǎn)錄本分析
            2.7 差異表達蛋白的IPA分析
            2.8 差異表達蛋白的免疫熒光驗證
            2.9 差異表達蛋白的Western blot鑒定
        3 討論
            3.1 病毒感染與干擾素誘導效應蛋白
            3.2 病毒感染與RNA加工、凋亡相關(guān)蛋白
    第二章 RhoGDI及其相關(guān)信號通路蛋白在雞傳染性法氏囊病病毒感染中的功能分析
        搞要
        1 材料與方法
            1.1 實驗材料
                1.1.1 病毒,細胞、載體和抗體
                1.1.2 試劑、材料和儀器
            1.2 實驗方法
                1.2.1 感染樣品的制備
                1.2.2 總RNA抽提
                1.2.3 反轉(zhuǎn)錄
                1.2.4 Real-time PCR與數(shù)據(jù)分析
                1.2.5 Western blot驗證
                1.2.6 脂質(zhì)體介導的細胞轉(zhuǎn)染
                1.2.7 免疫熒光(IFA)驗證
                1.2.8 免疫共沉淀分析
                1.2.9 RhoGDI的過表達
                1.2.10 病毒滴度測定
        2 結(jié)果
            2.1 IBDV感染對宿主DF-1細胞RhoGDI及相關(guān)信號通路基因轉(zhuǎn)錄水平的影響
            2.2 IBDV感染對宿主DF-1細胞RhoGDI蛋白水平的檢測
            2.3 真核過表達RhoGDI對病毒的主要編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平的影響
            2.4 真核過表達RhoGDI對病毒的主要編碼蛋白表達水平的影響
            2.5 真核過表達RhoGDI對IBDV病毒滴度的影響
            2.6 真核過表達病毒編碼蛋白VP3對RhoGDI轉(zhuǎn)錄水平的影響
            2.7 真核過表達病毒編碼蛋白VP3對RhoGDI的蛋白表達水平的影響
            2.8 IBDV編碼蛋白VP3與RhoGDI效應蛋白RhoA的相互作用分析
        3 討論
總結(jié)與展望
參考文獻
第三部分 附錄
    附錄A 縮略詞
    附錄B 常用緩沖液及培養(yǎng)基配方
    附錄C 攻讀博士期間錄用或待發(fā)表的學術(shù)論文
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]應用蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選胰腺癌生物標志物的研究進展[J]. 劉輝,張海婧,陳國強,呂麗艷,李智立.  世界華人消化雜志. 2007(14)
[2]傳染性法氏囊病毒的抗原及分子特征(英文)[J]. 周繼勇,葉菊秀,葉偉成,陳慶新,鄭肖娟,郭軍慶.  生物化學與生物物理進展. 2005(01)

博士論文
[1]傳染性法氏囊病病毒VP4蛋白磷酸化修飾的研究[D]. 王三應.浙江大學 2013
[2]狂犬病毒感染的神經(jīng)細胞差異蛋白質(zhì)組學研究及伴侶素CCTγ的功能分析[D]. 張金陽.浙江大學 2012
[3]傳染性法氏囊病毒感染雞靶器官的比較蛋白質(zhì)組研究[D]. 吳永平.浙江大學 2009
[4]傳染性法氏囊病毒感染的生物標記與細胞SAGE文庫的鑒定[D]. 王永志.浙江大學 2009
[5]豬圓環(huán)病毒2型感染PK-15細胞差異蛋白質(zhì)組研究[D]. 張鑫.浙江大學 2009
[6]傳染性法氏囊病病毒感染細胞的差異蛋白質(zhì)組學研究[D]. 鄭肖娟.浙江大學 2007
[7]傳染性法氏囊病毒粒子感染及其A節(jié)段編碼基因轉(zhuǎn)化細胞的轉(zhuǎn)錄本初步分析[D]. 葉菊秀.浙江大學 2006



本文編號：3216830