本文關鍵詞：小反芻獸疫病毒囊膜糖蛋白和受體的相互作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：小反芻獸疫(PPR)是由小反芻獸疫病毒(PPRV)引起野生和家養(yǎng)小反芻動物的一種急性、高度傳染性病毒病,是世界動物衛(wèi)生組織法定必須報告的動物疫病。PPRV是副粘病毒科麻疹病毒屬的成員,是一種囊膜病毒。一般來說,病毒通過識別、結合特異性受體進而侵入宿主細胞。副粘病毒在侵入細胞的過程中通過兩種囊膜糖蛋白——血凝素蛋白H和融合蛋白F,它們介導病毒囊膜和宿主細胞膜的融合過程。麻疹病毒屬病毒血凝素蛋白H的主要作用是與宿主細胞膜受體發(fā)生結合,調節(jié)病毒吸附并侵入宿主細胞,是決定病毒能否感染的關鍵因素;F蛋白作為融合的直接作用蛋白,是決定副粘病毒毒力的主要因素,它不僅直接參與病毒囊膜與宿主細胞膜的融合,而且也可以介導宿主臨近細胞間的融合。HR1和HR2是F基因中的兩段保守序列,對病毒囊膜和宿主細胞膜的融合有重要的意義�，F(xiàn)已確定的PPRV的天然受體有兩個:信號淋巴激活分子(SLAM)和脊髓灰質炎病毒受體(Nectin4/PVRL4),同時這兩種受體也是麻疹病毒和犬瘟熱病毒等的受體。本研究做了以下工作:(一)PPRV囊膜糖蛋白基因和受體基因的真核表達。構建SLAM、HR1和HR2真核表達重組質粒pCMV-Myc-SLAM、pCMV-HA-HR1和pCMV-HA-HR2,提取本實驗室保存的)疫苗株血凝素蛋白(Hv)、野毒株血凝素蛋白(Hw)、脊髓灰質炎病毒受體4(Nectin4)和融合蛋白(F)的重組質粒pCMV-HA-Hv、pCMV-HA-Hw、pCMV-Myc-Nectin4、pCAGGS-Flag-F,所有質粒均分別轉染CHO細胞,通過間接免疫熒光(IF)、流式細胞術(FCM)和Western-blot分析蛋白的表達。Western-blot分析所表達的目的蛋白大小與預期大小一致;IF結果顯示轉染pCMV-HA-Hv、pCMV-HA-Hw、pCMV-HA-HR1和pCMV-HA-HR2質粒的CHO細胞出現(xiàn)綠色熒光,轉染pCMV-Myc-SLAM和pCMV-Myc-Nectin4質粒的CHO細胞出現(xiàn)紅色熒光,轉染pCAGGS-Flag-F質粒的CHO細胞出現(xiàn)藍色熒光,說明目的蛋白與載體的標簽蛋白融合表達;FCM結果顯示用抗標簽蛋白的單抗作一抗,間接免疫熒光標記目的蛋白的陽性率高于同型對照的陽性率,說明重組質粒均在CHO細胞中大量表達。(二)PPRV表面糖蛋白H、F與受體之間的互作分析。將SLAM(或Nectin4)重組質粒分別與Hv、Hw、HR1和HR2共轉染CHO細胞,IF結果表明受體SLAM、Nectin4與Hv、Hw、HR1和HR2在細胞質內共表達,并且蛋白發(fā)生了共定位;Co-IP結果表明受體SLAM、Nectin4分別可以沉淀Hv、Hw、HR1和HR2蛋白,同時Hv、Hw、HR1和HR2蛋白也可以沉淀受體SLAM、Nectin4,說明SLAM(或Nectin4)分別可以和Hv、Hw、HR1及HR2相互作用。純化重組蛋白,用表面等離子共振分析粘附蛋白H分別與受體SLAM和Nectin4及F蛋白、HR1、HR2間的結合力。結果顯示,Hv和Hw蛋白最合適的偶聯(lián)緩沖液均為pH5.0的10mM乙酸鈉,偶聯(lián)量分別為6438.7和7881.7RU;Hv和Hw與F、HR1、HR2、SLAM、Nectin4間均存在相互作用力,除HR1外,Hv與其余蛋白均具有高結合力,平衡解離常數(shù)KD介于1.3×10-10~3.87×10-8之間;Hw與SALM的結合力最小,平衡解離常數(shù)KD僅為1.21×10-5,與其余蛋白均具有高結合力,平衡解離常數(shù)KD介于7.1×10-12~5.97×10-8之間。(三)PPRV表面糖蛋白H和F的促細胞融合作用分析。將SLAM(或Nectin4)的重組質粒與H和F重組質粒共轉染于CHO細胞,36 h后用普通光學顯微鏡分析受體和兩種囊膜蛋白的相互作用對細胞融合的影響,用共聚焦顯微鏡分析蛋白的定位。通過光學顯微鏡觀察到受體SLAM或Nectin4與融合蛋白以及粘附蛋白H共表達可以引起細胞融合,此外共表達受體蛋白和融合蛋白F也可以引起細胞融合。共聚焦顯微鏡觀察到同時轉染受體SLAM(或Nectin4)、H和F質粒,三種蛋白共表達,蛋白分布出現(xiàn)了極化現(xiàn)象并且不同蛋白分布發(fā)生了共定位。
【關鍵詞】：小反芻獸疫病毒 粘附蛋白 融合蛋白 天然受體 相互作用
【學位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要3-5
• Summary5-7
• 英文縮略表7-11
• 第一篇 綜述11-30
• 1 PPRV研究進展12-19
• 1.1 PPRV分子病原學特點12-13
• 1.1.1 病毒理化特性12
• 1.1.2 病毒粒子結構12
• 1.1.3 基因組結構12-13
• 1.2 病毒的復制13-16
• 1.2.1 吸附和侵入13-15
• 1.2.2 轉錄和復制15-16
• 1.2.3 病毒的組裝和釋放16
• 1.3 致病機理16-18
• 1.4 易感動物和對PPRV的抵抗力18-19
• 2 副粘病毒屬的融合機制19-30
• 2.1 H蛋白的結構和在激活融合中的作用19-22
• 2.2 F蛋白的結構和在激活融合中的作用22-23
• 2.3 MV-H與受體SLAM和Nectin4的相互作用機制23-30
• 2.3.1 MV-H和SLAM的相互作用23-27
• 2.3.2 MV-H和Nectin4的相互作用27
• 2.3.3 MV-H和與這三個受體之間結合的比較27-30
• 第二篇 試驗部分30-64
• 第一章 PPRV囊膜糖蛋白基因和受體基因的真核表達30-45
• 1 材料與方法31-38
• 1.1 毒株?載體和菌種31
• 1.2 試劑及酶31
• 1.3 培養(yǎng)基及溶液31-32
• 1.4 SLAM蛋白基因真核表達載體構建32-35
• 1.4.1 SLAM蛋白基因引物的設計32
• 1.4.2 SLAM蛋白基因的PCR擴增32-33
• 1.4.3 SLAM蛋白基因PCR產(chǎn)物的純化33
• 1.4.4 p CMV-Myc載體質粒的提取33-34
• 1.4.5 目的片段與載體的雙酶切及回收34
• 1.4.6 重組質粒的連接34
• 1.4.7 連接產(chǎn)物的轉化、重組質粒陽性克隆的篩選和鑒定34-35
• 1.5 F蛋白七肽重復區(qū)基因真核表達載體的構建35-36
• 1.5.1 HR1和HR2蛋白基因引物的設計35
• 1.5.2 HR1和HR2蛋白基因的PCR擴增35-36
• 1.6 重組質粒的真核表達與檢測36-38
• 1.6.1 重組質粒轉染CHO細胞36
• 1.6.2 間接免疫熒光檢測檢測重組質粒在CHO細胞中的表達36-37
• 1.6.3 流式細胞術檢測重組質粒在CHO細胞中的表達37-38
• 1.6.4 Western blotting檢測重組質粒在CHO細胞中的表達38
• 2 結果38-43
• 2.1 重組表達質粒的構建與鑒定38-41
• 2.1.1 SLAM重組表達質粒的構建與鑒定38
• 2.1.2 HR1和HR2重組表達質粒的構建與鑒定38-40
• 2.1.3 間接免疫熒光法檢測重組真核表達質粒的表達40-41
• 2.2 流式細胞術（FCM）檢測重組真核表達質粒的表達41-43
• 2.3 重組質粒表達蛋白的Western blotting檢測43
• 3 討論43-45
• 第二章 PPRV表面糖蛋白和受體蛋白之間的相互作用45-58
• 1 材料與方法46-48
• 1.1 試劑及儀器46
• 1.2 間接免疫熒光檢測蛋白表達和定位46-47
• 1.3 Co-IP檢測蛋白之間的相互作用47
• 1.4 表面等離子共振（SPR）檢測蛋白之間的相互作用47-48
• 2 結果48-57
• 2.1 共聚焦顯示共轉染質粒在CHO細胞中共表達且共定位于同一層面48-49
• 2.2 免疫共沉淀顯示共轉染的兩種質粒共表達且蛋白有相互作用49-52
• 2.3 SPR表明粘附蛋白H與兩種受體和融合蛋白都有相互作用52-57
• 3 討論57-58
• 第三章 PPRV表面糖蛋白H和F的促融合作用研究58-64
• 1 材料和方法58-59
• 1.1 材料58-59
• 1.2 轉染CHO細胞59
• 1.3 免疫熒光檢測蛋白表達和細胞融合試驗59
• 1.4 激光共聚焦觀察極化現(xiàn)象59
• 2 結果59-63
• 2.1 F和受體Sl AM可以促進細胞融合59-60
• 2.2 H和F蛋白在細胞中發(fā)生共定位60-63
• 3 討論63-64
• 結論64-65
• 參考文獻65-71
• 致謝71-72
• 個人簡介72-73
• 導師簡介73-74

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本文編號：321481