本文關(guān)鍵詞：小反芻獸疫病毒囊膜糖蛋白和受體的相互作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：小反芻獸疫(PPR)是由小反芻獸疫病毒(PPRV)引起野生和家養(yǎng)小反芻動(dòng)物的一種急性、高度傳染性病毒病,是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織法定必須報(bào)告的動(dòng)物疫病。PPRV是副粘病毒科麻疹病毒屬的成員,是一種囊膜病毒。一般來說,病毒通過識別、結(jié)合特異性受體進(jìn)而侵入宿主細(xì)胞。副粘病毒在侵入細(xì)胞的過程中通過兩種囊膜糖蛋白——血凝素蛋白H和融合蛋白F,它們介導(dǎo)病毒囊膜和宿主細(xì)胞膜的融合過程。麻疹病毒屬病毒血凝素蛋白H的主要作用是與宿主細(xì)胞膜受體發(fā)生結(jié)合,調(diào)節(jié)病毒吸附并侵入宿主細(xì)胞,是決定病毒能否感染的關(guān)鍵因素;F蛋白作為融合的直接作用蛋白,是決定副粘病毒毒力的主要因素,它不僅直接參與病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜的融合,而且也可以介導(dǎo)宿主臨近細(xì)胞間的融合。HR1和HR2是F基因中的兩段保守序列,對病毒囊膜和宿主細(xì)胞膜的融合有重要的意義�，F(xiàn)已確定的PPRV的天然受體有兩個(gè):信號淋巴激活分子(SLAM)和脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(Nectin4/PVRL4),同時(shí)這兩種受體也是麻疹病毒和犬瘟熱病毒等的受體。本研究做了以下工作:(一)PPRV囊膜糖蛋白基因和受體基因的真核表達(dá)。構(gòu)建SLAM、HR1和HR2真核表達(dá)重組質(zhì)粒pCMV-Myc-SLAM、pCMV-HA-HR1和pCMV-HA-HR2,提取本實(shí)驗(yàn)室保存的)疫苗株血凝素蛋白(Hv)、野毒株血凝素蛋白(Hw)、脊髓灰質(zhì)炎病毒受體4(Nectin4)和融合蛋白(F)的重組質(zhì)粒pCMV-HA-Hv、pCMV-HA-Hw、pCMV-Myc-Nectin4、pCAGGS-Flag-F,所有質(zhì)粒均分別轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,通過間接免疫熒光(IF)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和Western-blot分析蛋白的表達(dá)。Western-blot分析所表達(dá)的目的蛋白大小與預(yù)期大小一致;IF結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pCMV-HA-Hv、pCMV-HA-Hw、pCMV-HA-HR1和pCMV-HA-HR2質(zhì)粒的CHO細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光,轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-SLAM和pCMV-Myc-Nectin4質(zhì)粒的CHO細(xì)胞出現(xiàn)紅色熒光,轉(zhuǎn)染pCAGGS-Flag-F質(zhì)粒的CHO細(xì)胞出現(xiàn)藍(lán)色熒光,說明目的蛋白與載體的標(biāo)簽蛋白融合表達(dá);FCM結(jié)果顯示用抗標(biāo)簽蛋白的單抗作一抗,間接免疫熒光標(biāo)記目的蛋白的陽性率高于同型對照的陽性率,說明重組質(zhì)粒均在CHO細(xì)胞中大量表達(dá)。(二)PPRV表面糖蛋白H、F與受體之間的互作分析。將SLAM(或Nectin4)重組質(zhì)粒分別與Hv、Hw、HR1和HR2共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,IF結(jié)果表明受體SLAM、Nectin4與Hv、Hw、HR1和HR2在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)共表達(dá),并且蛋白發(fā)生了共定位;Co-IP結(jié)果表明受體SLAM、Nectin4分別可以沉淀Hv、Hw、HR1和HR2蛋白,同時(shí)Hv、Hw、HR1和HR2蛋白也可以沉淀受體SLAM、Nectin4,說明SLAM(或Nectin4)分別可以和Hv、Hw、HR1及HR2相互作用。純化重組蛋白,用表面等離子共振分析粘附蛋白H分別與受體SLAM和Nectin4及F蛋白、HR1、HR2間的結(jié)合力。結(jié)果顯示,Hv和Hw蛋白最合適的偶聯(lián)緩沖液均為pH5.0的10mM乙酸鈉,偶聯(lián)量分別為6438.7和7881.7RU;Hv和Hw與F、HR1、HR2、SLAM、Nectin4間均存在相互作用力,除HR1外,Hv與其余蛋白均具有高結(jié)合力,平衡解離常數(shù)KD介于1.3×10-10~3.87×10-8之間;Hw與SALM的結(jié)合力最小,平衡解離常數(shù)KD僅為1.21×10-5,與其余蛋白均具有高結(jié)合力,平衡解離常數(shù)KD介于7.1×10-12~5.97×10-8之間。(三)PPRV表面糖蛋白H和F的促細(xì)胞融合作用分析。將SLAM(或Nectin4)的重組質(zhì)粒與H和F重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于CHO細(xì)胞,36 h后用普通光學(xué)顯微鏡分析受體和兩種囊膜蛋白的相互作用對細(xì)胞融合的影響,用共聚焦顯微鏡分析蛋白的定位。通過光學(xué)顯微鏡觀察到受體SLAM或Nectin4與融合蛋白以及粘附蛋白H共表達(dá)可以引起細(xì)胞融合,此外共表達(dá)受體蛋白和融合蛋白F也可以引起細(xì)胞融合。共聚焦顯微鏡觀察到同時(shí)轉(zhuǎn)染受體SLAM(或Nectin4)、H和F質(zhì)粒,三種蛋白共表達(dá),蛋白分布出現(xiàn)了極化現(xiàn)象并且不同蛋白分布發(fā)生了共定位。
【關(guān)鍵詞】：小反芻獸疫病毒 粘附蛋白 融合蛋白 天然受體 相互作用
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要3-5
• Summary5-7
• 英文縮略表7-11
• 第一篇 綜述11-30
• 1 PPRV研究進(jìn)展12-19
• 1.1 PPRV分子病原學(xué)特點(diǎn)12-13
• 1.1.1 病毒理化特性12
• 1.1.2 病毒粒子結(jié)構(gòu)12
• 1.1.3 基因組結(jié)構(gòu)12-13
• 1.2 病毒的復(fù)制13-16
• 1.2.1 吸附和侵入13-15
• 1.2.2 轉(zhuǎn)錄和復(fù)制15-16
• 1.2.3 病毒的組裝和釋放16
• 1.3 致病機(jī)理16-18
• 1.4 易感動(dòng)物和對PPRV的抵抗力18-19
• 2 副粘病毒屬的融合機(jī)制19-30
• 2.1 H蛋白的結(jié)構(gòu)和在激活融合中的作用19-22
• 2.2 F蛋白的結(jié)構(gòu)和在激活融合中的作用22-23
• 2.3 MV-H與受體SLAM和Nectin4的相互作用機(jī)制23-30
• 2.3.1 MV-H和SLAM的相互作用23-27
• 2.3.2 MV-H和Nectin4的相互作用27
• 2.3.3 MV-H和與這三個(gè)受體之間結(jié)合的比較27-30
• 第二篇 試驗(yàn)部分30-64
• 第一章 PPRV囊膜糖蛋白基因和受體基因的真核表達(dá)30-45
• 1 材料與方法31-38
• 1.1 毒株?載體和菌種31
• 1.2 試劑及酶31
• 1.3 培養(yǎng)基及溶液31-32
• 1.4 SLAM蛋白基因真核表達(dá)載體構(gòu)建32-35
• 1.4.1 SLAM蛋白基因引物的設(shè)計(jì)32
• 1.4.2 SLAM蛋白基因的PCR擴(kuò)增32-33
• 1.4.3 SLAM蛋白基因PCR產(chǎn)物的純化33
• 1.4.4 p CMV-Myc載體質(zhì)粒的提取33-34
• 1.4.5 目的片段與載體的雙酶切及回收34
• 1.4.6 重組質(zhì)粒的連接34
• 1.4.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒陽性克隆的篩選和鑒定34-35
• 1.5 F蛋白七肽重復(fù)區(qū)基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建35-36
• 1.5.1 HR1和HR2蛋白基因引物的設(shè)計(jì)35
• 1.5.2 HR1和HR2蛋白基因的PCR擴(kuò)增35-36
• 1.6 重組質(zhì)粒的真核表達(dá)與檢測36-38
• 1.6.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞36
• 1.6.2 間接免疫熒光檢測檢測重組質(zhì)粒在CHO細(xì)胞中的表達(dá)36-37
• 1.6.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測重組質(zhì)粒在CHO細(xì)胞中的表達(dá)37-38
• 1.6.4 Western blotting檢測重組質(zhì)粒在CHO細(xì)胞中的表達(dá)38
• 2 結(jié)果38-43
• 2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定38-41
• 2.1.1 SLAM重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定38
• 2.1.2 HR1和HR2重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定38-40
• 2.1.3 間接免疫熒光法檢測重組真核表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)40-41
• 2.2 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測重組真核表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)41-43
• 2.3 重組質(zhì)粒表達(dá)蛋白的Western blotting檢測43
• 3 討論43-45
• 第二章 PPRV表面糖蛋白和受體蛋白之間的相互作用45-58
• 1 材料與方法46-48
• 1.1 試劑及儀器46
• 1.2 間接免疫熒光檢測蛋白表達(dá)和定位46-47
• 1.3 Co-IP檢測蛋白之間的相互作用47
• 1.4 表面等離子共振（SPR）檢測蛋白之間的相互作用47-48
• 2 結(jié)果48-57
• 2.1 共聚焦顯示共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在CHO細(xì)胞中共表達(dá)且共定位于同一層面48-49
• 2.2 免疫共沉淀顯示共轉(zhuǎn)染的兩種質(zhì)粒共表達(dá)且蛋白有相互作用49-52
• 2.3 SPR表明粘附蛋白H與兩種受體和融合蛋白都有相互作用52-57
• 3 討論57-58
• 第三章 PPRV表面糖蛋白H和F的促融合作用研究58-64
• 1 材料和方法58-59
• 1.1 材料58-59
• 1.2 轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞59
• 1.3 免疫熒光檢測蛋白表達(dá)和細(xì)胞融合試驗(yàn)59
• 1.4 激光共聚焦觀察極化現(xiàn)象59
• 2 結(jié)果59-63
• 2.1 F和受體Sl AM可以促進(jìn)細(xì)胞融合59-60
• 2.2 H和F蛋白在細(xì)胞中發(fā)生共定位60-63
• 3 討論63-64
• 結(jié)論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-71
• 致謝71-72
• 個(gè)人簡介72-73
• 導(dǎo)師簡介73-74

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