旨在采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）和橫向流動試紙條（LFD）相結(jié)合的方法,建立一種快速、特異,過程可視化的豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）檢測方法。針對豬肺炎支原體（Mhp）P36基因設(shè)計(jì)5套特異性引物和1條異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的探針,進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)。將生物素標(biāo)記的LAMP產(chǎn)物與FITC標(biāo)記的探針進(jìn)行特異性雜交,并使用橫向流動試紙條完成擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。經(jīng)優(yōu)化,LAMP最佳反應(yīng)條件為65℃,反應(yīng)15 min,從基因組DNA提取到LFD結(jié)果判斷只需40 min左右,比常規(guī)PCR技術(shù)縮短近2 h。LAMP-LFD可特異性地檢出豬肺炎支原體（Mhp）,對豬鼻支原體（Mhr）及豬圓環(huán)病毒（PCV）等常見豬病病原的檢測結(jié)果為陰性。靈敏性試驗(yàn)表明,LAMP-LFD對Mhp的檢測靈敏度為1×10⁰個(gè)拷貝DNA,是普通PCR的1 000倍。利用本方法可從采集的88份臨床疑似病料樣品中檢測到64份陽性,國標(biāo)PCR方法可檢測到56份陽性,符合率可達(dá)90.9%。綜上,本研究建立的LAMP-LFD方法可特異、準(zhǔn)確地應(yīng)用于Mhp的檢測,... 

【文章來源】：畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020,51(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：10 頁

【部分圖文】：

LAMP-LFD特異性檢測結(jié)果

以Mhp基因組DNA為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物分別用瓊脂糖凝膠電泳、SYBR Green Ⅰ、LFD進(jìn)行檢測,驗(yàn)證該方法的可行性。結(jié)果顯示,通過瓊脂糖凝膠電泳,陽性出現(xiàn)明顯的階梯狀條帶,而陰性對照無條帶(圖5A);SYBR Green Ⅰ通過肉眼可見陽性顯現(xiàn)黃綠色,而陰性為橘黃色,在紫外分析儀下,陽性發(fā)出強(qiáng)烈的黃綠色熒光,而陰性呈現(xiàn)橘色(圖5B);LFD顯示,陽性在檢測線和控制線區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)2條紅線,而陰性僅在控制線出現(xiàn)1條紅線(圖5C)。因此,LAMP-LFD檢測方法可行。圖2 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3212037